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色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支,从20世纪初俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法后,色谱分析法取得迅速发展.作为色谱分析法的一个分枝,高效液相色谱法是在20世纪60年代末期,在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上,发展起来的新型分离分析技术.
关键词: 色谱法、高效液相色谱法、分配系数、塔板理论.
1、色谱法原理
1.1 概述
色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。
1.2色谱法分类
1.2.1 按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）．液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。
1.2.2按分离机理分类
利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。
1.2.3 按固定相的外形分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。
1.3 色谱流出曲线及有关术语
1.3.1流出曲线和色谱峰
如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：
式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。
1.3.2基线
是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线．
1.3.3峰高
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。
1.3.4保留值
1.3.4.1死时间tM
不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用往长L与tM的比值计算。
1.3.4.2保留时间tR
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间.它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间.
1.3.4.3调整保留时间tR′
某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即
tR′ = tR-tM
由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停留的总时间．保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。
保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定．
1.3.4.4死体积 VM
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和．当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（L／min）计算：
VM = tM·F0
1.3.4.5保留体积 VR
指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：
VR = tR·F0
1.3.4.6调整保留体积VR′
某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即
VR′ = VR- VM
1.3.4.7相对保留值γ2.1
某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：
1.3.4.8选择因子
在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值．此时，ri/s可能大于1，也可能小于1．在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示：
式中tR2′为后出峰的调整保留时间，所以这时α总是大于1的 。
1.3.5区域宽度
色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：
1.3.5.1标准偏差σ
即0．607倍峰高处色谱峰宽的一半。
1.3.5.2 半峰宽W1/2
即峰高一半处对应的峰宽．它与标准偏差σ的关系是：
W1/2 = 2.354σ
1.3.5.3 基线宽度W
即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，它与标准偏差的关系是：
W = 4σ
1.3.5.4从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：
（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数．
（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．
(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．
（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．
（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．
1.4 色谱法分析的基本原理
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
1.4.1分配系数K和分配比k
1.4.1.1分配系数K
如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即
1.4.1.2分配比k
分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即
k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比k值可直接从色谱图测得。
1.4.1.3分配系数K与分配比k的关系
其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6～35；对毛细管柱，其β值为60～600。
1.4.1.4分配系数K及分配比k与选择因子α的关系
对A、B两组分的选择因子，用下式表示
式（18-23）表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。
1.4.2 塔板理论
最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。L
n=-----
H
该理论假定：
（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。
（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。
（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。
（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。
为简单起见，设色谱柱由5块塔板（n＝5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2…，n－l；某组分的分配比k=1.
根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可得结果如下：
开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0．5，其中气液（或气固）两相各为0．25而1号板上所含总量同样为0．5．气液（或气固）相亦各为0．25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次。
由流出曲线方程可推出：
而理论塔板高度（H）即：
从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。
通常填充色谱柱的n＞103，H＜1mm。而毛细管柱 n=105--106，H＜0.5mm.
塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。
2 高效液相色谱法发展状况
高效液相色谱方法在20世纪60年代初期创立，当时色谱工作者使用大于100μm粒径的粒子填充高效液相色谱柱，投入商业使用的集中在凝胶渗透色谱来测定高聚物分子量。随后Hamilton和Giddings在HPLC理论方面进行了先导性的工作,Hubor使用＜20um的填料获得了高柱效,Scott进行了高压离子交换色谱工作。因此在20世纪60年代末期，高效液相色谱已取得技术上的突破，研究方法呈现多样化。
20世纪70年代确立了往复式双柱塞恒流泵在HPLC仪器中使用的主导地位。Varian公司首先研制出适于梯度洗脱的可变波长紫外吸收检测器。从无定形微粒硅胶到平均粒径7μm的全多孔球硅胶，及平衡密度匀浆装柱技术的发展，制备出了理论塔板高度仅为0.1mm的高效柱。大量商品键合固定相的广泛使用，其稳定性获得很大改进，使一个商品键合相柱用于几千次的分离成为可能。
20世80年代Hewlett-Packard公司首先研制出二极管阵列紫外吸收检测器，使检测灵敏度提高到10-9数量级，窄孔柱和微柱的扩展应用于微量和超微量分析，减少了流动相的消耗。在此期间微型计算机及程序软件的应用，对HPLC方法的发展下起到很大的促进作用成为开拓HPLC方法发展的新途径。
在20世纪90年代以来HPLC已发展到可与GC相近的程度，在分析仪器的销售中已提高到首位。其突出成果有几以下几个方面。
(1)、新型固定相的研制
① 耐高压、高交联度的球形微粒聚合物固定相，如单分散、全多孔的苯乙烯基苯共聚微球（粒径10μm、孔径10～100nm）
②为完全消除硅醇基的吸附效应，研制了具有立体阻碍或静电屏蔽效应的新型单齿和双齿硅胶键合固定相。
③制备了具有大的流通孔尺寸/骨架尺寸比值的整体色谱柱，实现了快速分析。
(2)、新型流动相的使用
20世纪90年代末期出现了用120～220℃超热水作为流动相的HPLC，它利用超热水具有较低的介电常数来增强其洗脱强度，又称绿色流动相。
(3)、新型检测器的扩展应用和HPLC仪器自动化程度的迅速提高
20世纪90年代蒸发光散射检测器，由于具有以质量检测的通用性质，迅速扩展了的多肽、蛋白质、核酸等生物大分子分析中的应用。
由于单板机的广泛应用和个人用计算机功能的扩展，使HPLC仪器配备了自动进样器，色谱操作参数的自动控制，智能化的数据和谱图处理功能大大提高了HPLC仪器的自动化水平。
(4)、全新分析方法的涌现
①使用“并列整体载体结构”的微芯片制作技术，并采用电渗泵，扩展了纳米液相色谱技术的使用。
②使用0.1um的填料，填充内径30μm长50cm的熔融硅毛细管柱，在约400Mpa的压力，实现了超高压液相色谱技术，可获得理论塔板数高达20万～30万的高柱效。
③用于大分子分离的剪切驱动流路液相色谱已经出现，其使用剪切力来取代常用的液体压力或电压驱动方法，使用全新的微芯片结构，利用黏滞阻力效应，对大分子的分离不仅提高了分析速度并增大了分离度。
(5)、多维液相色谱和联用技术的快速发展
①为解决日益复杂的分析任务，在HPLC中迅速发展了全二维液相色谱技术，如阳离子交换色谱和反相液相色谱联用已在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
②HPLC已实现与质谱或核磁共振联用，在解决复杂组成物质的结构分析中，成为强有力的工具。
现在HPLC经历近40年的发展，色谱工作者可对任何类型的分离提供适用的色谱柱及相应的分离条件，并可在短的时间内，利用计算机提供的软件计算程序，获得可包含40个组分的优化完全分离。现在除低沸点化合物使用GC分析外，其他样品都可用HPLC进行分析。但随着质谱分析技术的快速发展，可以预见质谱分析将在当代发展成为继色谱分析之后的，一种通用的分离和分析方法。
