质粒酶切电泳 pcr产物要酶切吗

这个问题,我们实验室也遇到过几次,在反复验证后,大体总结如下:

1、先确定质粒克隆的菌种是什么,是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌?不同的宿主菌提取质粒的产率不一样,如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株,可以考虑下面几种情况

2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗,还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照?如果没有做对照,就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解;如果做了对照,而对照(即未酶切的质粒)仍然可以跑出正常的条代,酶切产物却没有条代(或者电泳孔道呈弥散状),这时考虑下面的情况。

3、虽然你换过了酶,但双酶切的buffer是否有换?如果没换,就应考虑是否是buffer的问题,或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因,可考虑下面一个原因,也许是最重要的因素

4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题,刚提完的质粒(未酶切)跑电泳,条代非常漂亮,可再拿来做酶切后电泳,整个用到呈现弥散状白色一片,或者什么都没有。为了解决这个问题,我们对整个过程进行了检测。

首先检测是否是融解质粒的TE问题,最后将此问题排除

然后检测是否是质粒本身的问题,酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照(注意,该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的,顺便说一句,我们也用碱裂解法),发现阳性的质粒对照条代完好,而酶切的质粒条代弥散或者空白,未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代(尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的)

这时我们怀疑提质粒过程是否有问题,于是我们去别的实验室,用同样的菌液去提质粒,提完后,其中一部分用别的实验室的TE融解,一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳,结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。

于是我们对溶液1,2,3全部换成新的,然后用同样的菌液重提质粒,再酶切后电泳,一切都OK了,

造成该状况的原因不是狠清楚,也许提质粒的溶液污染了,导致酶切后无条代。。。。。

这个问题,我们实验室也遇到过几次,在反复验证后,大体总结如下:

1、先确定质粒克隆的菌种是什么,是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌?不同的宿主菌提取质粒的产率不一样,如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株,可以考虑下面几种情况

2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗,还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照?如果没有做对照,就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解;如果做了对照,而对照(即未酶切的质粒)仍然可以跑出正常的条代,酶切产物却没有条代(或者电泳孔道呈弥散状),这时考虑下面的情况。

3、虽然你换过了酶,但双酶切的buffer是否有换?如果没换,就应考虑是否是buffer的问题,或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因,可考虑下面一个原因,也许是最重要的因素

4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题,刚提完的质粒(未酶切)跑电泳,条代非常漂亮,可再拿来做酶切后电泳,整个用到呈现弥散状白色一片,或者什么都没有。为了解决这个问题,我们对整个过程进行了检测。

首先检测是否是融解质粒的TE问题,最后将此问题排除

然后检测是否是质粒本身的问题,酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照(注意,该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的,顺便说一句,我们也用碱裂解法),发现阳性的质粒对照条代完好,而酶切的质粒条代弥散或者空白,未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代(尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的)

这时我们怀疑提质粒过程是否有问题,于是我们去别的实验室,用同样的菌液去提质粒,提完后,其中一部分用别的实验室的TE融解,一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳,结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。

于是我们对溶液1,2,3全部换成新的,然后用同样的菌液重提质粒,再酶切后电泳,一切都OK了,

造成该状况的原因不是狠清楚,也许提质粒的溶液污染了,导致酶切后无条代。。。。。

1、先确定质粒克隆的菌种是什么,是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌?不同的宿主菌提取质粒的产率不一样,如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株,可以考虑下面几种情况

2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗,还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照?如果没有做对照,就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解;如果做了对照,而对照(即未酶切的质粒)仍然可以跑出正常的条代,酶切产物却没有条代(或者电泳孔道呈弥散状),这时考虑下面的情况。

3、虽然你换过了酶,但双酶切的buffer是否有换?如果没换,就应考虑是否是buffer的问题,或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因,可考虑下面一个原因,也许是最重要的因素

4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题,刚提完的质粒(未酶切)跑电泳,条代非常漂亮,可再拿来做酶切后电泳,整个用到呈现弥散状白色一片,或者什么都没有。为了解决这个问题,我们对整个过程进行了检测。

首先检测是否是融解质粒的TE问题,最后将此问题排除

然后检测是否是质粒本身的问题,酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照(注意,该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的,顺便说一句,我们也用碱裂解法),发现阳性的质粒对照条代完好,而酶切的质粒条代弥散或者空白,未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代(尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的)

这时我们怀疑提质粒过程是否有问题,于是我们去别的实验室,用同样的菌液去提质粒,提完后,其中一部分用别的实验室的TE融解,一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳,结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。
质粒酶切电泳 pcr产物要酶切吗

于是我们对溶液1,2,3全部换成新的,然后用同样的菌液重提质粒,再酶切后电泳,一切都OK了,

造成该状况的原因不是狠清楚,也许提质粒的溶液污染了,导致酶切后无条代。。。。。

用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像,即超螺旋,线形和开环。(开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链,因此电泳速度最慢)三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环,线形的质粒在中间,而开环的质粒在最后。

判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。因为用质粒转染真核细胞时,超螺旋的质粒效率最高,所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90%以上,这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。

根据我做实验的经验,回答你的问题

1 从细菌中大量提取的质粒电泳时,不一定均出现三条带,有时会出现两条,甚至一条(一般是超螺旋的质粒),这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤,超螺旋的质粒会较多。

2 酶切将质粒线性化以后,才可以用mark判断大小。如果有三种构像,可以用中间那条带与mark比较判断大小。

3 商品化的质粒我没有直接跑过电泳。我估计应该大部分是超螺旋构像。

4 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小

  

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