爱华网质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
蓝白斑筛选：
现在常用的质粒载体上都带有β-半乳糖激酶（LacZ）基因。载体上重组DNA的插入位点存在于特定遗传标记内部，外源DNA片段的插入会导致该遗传标记失活。本实验使用的载体含一个大肠杆菌DNA的小片段，其中含乳糖操纵子的启动子和β-半乳糖激酶基因，多克隆位点位于其编码区内。载体与编码β-半乳糖激酶C端的部分序列的宿主之间发生互补——α-互补，产生完整的β-半乳糖激酶活性的Lac+细菌。它们在生色底物存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入多克隆位点时，细菌不能产生β-半乳糖激酶，即使有生色底物存在，一般也会产生白色菌落。而无插入片段的重组细胞菌落将产生蓝色菌落。X-gal和IPTG是被用于鉴别蓝白菌落的底物，常涂布于固体培养基上。
质粒提取方法：
细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解可采用多种方法。这些方法包括用非离子型或离子型去垢剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。在实际操作中，可根据所使用的宿主菌及质粒的特性来选择合适的方法。本实验所介绍的碱裂解法提取质粒的方法是一种简便、快捷、效率高、消耗少的方法，适合于小量及大量、质粒的提取。其原理是用EDTA和SDS破坏细胞壁和细胞膜，使质粒DNA分子，多聚核糖体及其他可溶物质从细胞中逐步释放，而染色体DNA分子与细胞碎片缠绕在一起，可经离心与质粒DNA分开。
质粒电泳：
质粒电泳一般采用琼脂糖凝胶电泳。电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便、快速，可以分辨用其他方法所无法分离的DNA片段。此外，直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。少至1-10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。电泳后的DNA条带还可以从凝胶中回收，用于克隆操作。
影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有：
1）DNA分子的大小；2）DNA的构象；3）琼脂糖浓度；4）所用电压；5）碱基组成及电泳温度；6）电泳缓冲液的组成。
质粒提取的实验步骤（详见generay质抽试剂盒说明书）
1. 取1～2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用4～6ml菌液，通过多次离心将菌体收集到一个离心管中。
2. 加入200μl SolutionⅠ，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：* 确认Solution I中已加入RnaseA.
* 不要残留细小菌块，否则会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3. 加入200μl SolutionⅡ，立即温和并充分地上下翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过5min。
注意：* SolutionII使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和SolutionII中的NaOH发生中和反应，降低溶菌效率。
* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
4. 加入350μlSolutionⅢ，温和并充分地上下翻转混合8～10次，室温放置2～5min。12,000rpm，离心10min。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
5. 将步骤4中的上清转移到套放于2ml收集管内的GenCleanColumn中，室温6000rpm 离心1min，取出GenCleanColumn，倒掉收集管中废液。
注意：忌取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
6. 将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μl SolutionIV，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
7. 将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μl WashSolution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
8. 重复步骤7一次。
9. 倒掉收集管中废液，12,000 rpm，室温离心1min，彻底去除WashSolution。
注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。将GenClean柱室温开盖放置10min或50℃放置5min，将有助于彻底去除WashSolution中的乙醇。
10. 将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中，在GenCleanColumn膜中央加入50μl～70μl ElutionBuffer，37℃放置2min。12,000rpm，室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，取2～5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。
注意：将Elution Buffer或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
质粒检测：
1. 制备凝胶
称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到60℃左右，倒入封好的电泳板上。
2. 上样
1）吸取2 μL质粒，加入1μL上样缓冲液（Loading buffer），混匀。
2）将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中
3. 电泳
连接好电泳槽和电泳仪，以5V/cm恒压电泳。
4. 染色及脱色
电泳1.5-2 h后，关上电泳仪。取出凝胶，放入染色槽内，加入1滴溴化乙锭（EB）轻轻摇荡15分钟。将染色液倒入储存桶内，在染色槽内加入自来水，轻轻摇荡10分钟。
5. 结果观察
将凝胶放到紫外灯下观测。记录观察到的电泳条带
实验结果与分析
质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。
真空干燥后，无色，贴于管壁。
加ddH2O或TE能迅速溶解。
电泳凝胶上呈现一条亮带。
如果质粒提取中降解，则会出现上下三条带，分别代表超螺旋、带切口和带切刻的质粒。
溶解时不加RNase，则下部会有很亮的一片，为小分子RNA片段。
质粒中含太多杂质，则干燥后会呈白色或褐色，不易溶解。
常见问题分析
1．纯化质粒DNA时，一般使用多少菌体培养液比较合适?
根据我们的经验，如为高拷贝质粒（如：pUC18等)，使用2ml培养液与4ml培养液纯化的质粒DNA的收量差别不是很大，可以纯化得到10～15μg的高纯度质粒DNA。我们一般使用2ml的菌体培养液进行质粒DNA提取。
2．本试剂盒对低拷贝质粒的纯化提取情况如何?
针对低拷贝质粒时，使用4ml的菌体培养液进行质粒DNA的提取比较合适。如使用pBI121质粒时，在4ml的菌体培养液中，可以纯化提取2～3μg的高纯度质粒DNA。
3．为什么质粒DNA的收量较低?
一般情况下，从2ml的LB培养基进行过夜培养的pUC18/JM109培养液中，可以纯化得到约10～15μg的高纯度质粒DNA。质粒DNA收量较低时，可以从以下几个方面考虑：
（1）大肠杆菌太陈旧（在低温下的长期保存菌等)。请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
（2）质粒拷贝数低。使用低拷贝数载体时，每次产出的质粒DNA量会降低。
（3）确认操作过程的严密性。应严格按操作方法进行操作。
4．为什么加入Solution II后的溶菌液不澄清?
（1）菌体量过多，不能充分溶菌。使用本试剂盒时，每次可处理的菌体培养液为1-2 ml。
（2）菌体沉淀悬浮不充分。在加入SolutionI后，应使用振荡器（Vortex）等进行剧烈振荡使菌体沉淀充分悬浮后再做溶菌处理。
5．为什么质粒DNA测序结果不佳?
（1）模板DNA定量不准。请对质粒DNA正确定量。使用吸光度值定量时，有时DNA溶液中的不纯物会影响吸光度值的测定，此时建议使用琼脂糖凝胶电泳法进行定量。
（2）质粒DNA纯度不好。请严格遵守实验操作要求，使用新鲜菌体培养液提取质粒。
（3）洗脱液中盐离子浓度过高。建议进行DNA洗脱时用灭菌蒸馏水洗脱。
（4）DNA插入片段本身立体结构复杂。有些DNA立体结构复杂（如GC rich、重复序列等）时难以测序，应改进测序方法。
