转录组分析

转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。

应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。派森诺生物提供mRNA的转录本表达分析，通过获得研究对象基因组转录区域的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。

一、技术路线

转录组的高通量测序包含两部分内容：①有参考基因组的转录组分析(Transcriptome analysis withreference genome)；②无参考基因组的转录组分析(De novotranscriptomeanalysis)。

1、有参考基因组的转录组分析技术路线

优选平台：IlluminaHiSeq测序平台采用双端测序方法，单次测序获得的数据量大，能够得到更高的覆盖深度，检测更多低丰度的转录本。IlluminaMiSeq测序平台操作灵活，不需要跟别的样本凑足一个Run，只要您的样品准备好了，平台马上能为您运行。

派森诺生物Illumina 测序平台结合成熟的生物信息学分析系统，是基因组序列已知物种的转录组分析的最佳选择。

2、无参考基因组的转录组分析

优选平台：在Roche 454 FLX基础上发展起来的Roche 454FLX+，有着成熟的分析软件和分析流程，具有长度长的优势，易于后续拼接和生物信息分析，提供最接近转录本长度的高通量测序数据。

二、生物信息学分析

1）有参考基因组的转录组

a)原始数据统计和处理

b)map到基因组

c)基因组注释整理及表达量分析

d)表达差异分析

e)表达差异GO聚类分析

f)基因覆盖分析

g)SNP分析

h)KEGG pathway分析

i)可变剪切分析

j)基因结构优化以及新基因发现

2）无参考基因组的转录组

a)原始数据统计和处理

b)Contig和Unigene统计分析

c)Unigene功能注释

d)表达差异分析

e)表达差异GO聚类分析

f)KEGG pathway分析

g)SNP分析

h)SSR分析

三、 常见问题解答

1、Q: 转录组测序与其他方法相比有哪些优势？

A:相对于传统芯片而言，转录组测序应用范围广，无需预先设计探针或了解物种的基因信息，即可对任意物种进行转录组测序，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，同时能发现新的转录本，预测新的基因，检测可变剪切，SNPs，融合基因等，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

2、Q: 进行转录组测序有哪些注意事项？

A: 1)RNA的质量好坏会严重影响测序的质量：

①RNA的3’端发生降解，则无法通过3’端的poly A尾捕获mRNA，反转录后进行测序也无法得到全部的cDNA；

②若RNA的5’端发生降解，即使通过3’端的poly A捕获得到mRNA，测序结果也将出现明显的3’和5’偏向性。

2)若RNA浓度较低时，也会影响测序的质量。可通过增加PCR扩增循环数的方法获得足够的量用于后续测序。

3)测序信号和准确性会因文库中poly A多聚物的存在发生一定的偏差。

3、Q: 如何进行原核生物转录组分析？

A: 针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况，需要提供纯化后的原核生物mRNA或cDNA样品。

4、Q: 对于有参考基因组序列和没有参考基因组序列的情况，派森诺生物曾做过哪些物种的转录组测序分析？

A:派森诺生物已与国内外多个知名的高校与研究所开展了多种模式生物及主要农作物的转录组分析，例如玉米、鸡和人等十几个物种，从这些转录组的分析研究中发现了很多新结构、新基因，派森诺生物也做过多种无参考基因组物种的转录组测序和分析，包括鹅，绿藻等，为这些物种的深入研究奠定了良好的基础。

5、Q: 转录组测序需要多少测序量？

A:转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双 重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。①针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；②针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。

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