2010版中国药典培训回答第4部分:菌种传代与特定菌检测

2010版中国药典培训回答(第4部分:菌种传代与特定菌检测)

广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。

http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120415/3980531/

1.以第五代菌做阳性对照,实验过程中的接种按药典应该也算传代,那是否算是第六代菌呢?答:依然算第五代(接种的菌株算第5代,培养后算第6代)

答:其实验结果是算哪一代菌的?答:见上题

2.药典规定只能传代五次,此次实验结果是否有效?

答:有效

3.现在有无对照菌种可以购买?联络电话?

答:省药检所业务科销售药典规定的标准菌株,为第二代甘油冻存管,电话:020-81854392

2010版中国药典培训回答(第4部分:菌种传代与特定菌检测)

4.菌种发放单应包括什么信息?

答:根据自己工作的需要,大致包括:菌种名称,编号,来源,接收日期,接收人等。

5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个/ml。铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管,也是低温,是否也会影响它的活性?应如何保存?

答:可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存,保存在-30℃或更低温度,则可保持其活性。若是斜面或营养肉汤,建议室温保存。

6.工作菌株,25℃下可连续使用一周,这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。为何工作菌株不低温存放,而是25℃?

答:首先要说明,所有的操作应按药典要求来操作,这里的工作菌株指原液,工作菌株建议在2-8℃保存,但要注意的是,铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存,低温会损伤其活性。由于笔误,写成了25℃,请更正为2-8℃。

7.简单方便的厌氧培养方案?

答:硫乙醇酸盐培养基;固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。

8.甘油冻存管一定要-30℃吗?0℃以下不可以吗?

答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。我们的甘油冻存管保存在-30℃。

8.三糖铁斜面穿刺会断层,这是为什么?

答:产气菌产气使培养基断层,或培养基本身质量问题。

9.第一代菌种可不可以作为工作菌株使用?

答:我们不这样使用,因为担心菌株没有充分复壮,生化特性可能不典型。

10.制备菌悬液时,要使其在10~100cfu中,应多注意的地方是什么?

答:制定标准化操作规程,减少不同实验者带来的误差,接种量、培养温度和时间应每次一致。

11.铜绿假单胞菌不宜放冰箱内保管,但其营养肉汤液能否放在冰箱保管?

答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。能否放冰箱可自行验证。

12.黑曲霉的存放期如何验证?

答:通过孢子悬液计数和菌落特征,进行验证。

13.标准储备菌株必须进行纯度和特性确认?还是在必要情况下才做?

答:详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页,我们在制备标准贮备菌液前进行纯度和特性确认,最好在使用前再进行纯度和特性确认。

14.铜绿假单胞菌贮存温度应为多少度?

答:一般在10℃以上,甘油冻存管至少在-30℃以下。

15.制备工作菌种进行菌种保藏中的保存期是否要进行验证?

答:可参考2010年版《中国药典》标准操作规程(SOP),应进行验证。

16.验证用菌株可否使用ATCC?

答:如果按中国药典检验的,用CMCC

17.菌种鉴定该如何做?

答:请参考讲义内容。

18.药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中,培养18-24h再进行稀释,制备菌悬液,可否直接使用未过期工作菌种进行稀释来制备菌悬液?

答:按药典要求不行,如要使用,请自己验证。。

19.斜面低温保藏法:每一次的菌种传代都需要做菌种纯度鉴定吗?

答:建议制备斜面保存管前进行菌种纯度鉴定,以后的每次传代视具体情况而定。

20.如何比较快速有效判断菌液的浓度?除了可以用“比浊仪”参考,还有什么方法?

答:比浊仪只做辅助参考,还需通过平板计数来最后确认菌液的浓度。

21.曾于中检所中购买过黑曲霉的0代包子悬液,说明书上表示应于-20&--#8451;中保存,可保存一年,对于此保存唯独及效期,药企可否同法保存自制的黑曲霉孢子悬液?是否要验证?如何验证?

答:黑曲霉孢子悬液制备请参照2010版药典的相关内容。关于验证在前面的问题中已经回复。

22.菌种纯度确认,怎么确认,需确认哪些项目?

答:请参照2010版药典的相关内容。

23.细菌菌种接入营养肉汤中保存一周,这需要验证吗?、

答:建议做验证。

24.菌种斜面最多能保存菌几代?经冰箱保存的斜面菌种是否需复苏二次才能进行菌悬液配制?

答:药典规定,菌种传代不应超过5代。冰箱保存的斜面菌种复苏后即可使用。

25.革兰氏染色的时间一般多长时间,染色时间长了对结果有无影响?

答:详见讲义内容,应严格控制染色时间,否则对结果影响很大。

26.哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落,对氧化酶试验是否有影响?菌悬液的制备过程中,接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中,这个新鲜培养物怎么理解,冰箱保存斜面菌种是新鲜培养物吗?

答:没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验。新鲜培养物指刚培养好的菌株,冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物。

27.菌种鉴定时,一定要根据药典的所有试验做完,才能确认是某种菌株吗?可否省略一些试验?

答:请按药典规定来进行菌种鉴定,具体情况可能还要增加适宜的鉴定试验。

28.工作菌株可在25℃连续使用一周,是指同一代同一管的菌株吗?还是说同一代不同管的菌株?

答:笔误更正,同上一题。

29.若没有比浊仪,用什么方法来确认50~100cfu/ml?特别是孢子?

答:孢子计数建议通过平板计数的方法来确定浓度。

30.工作菌种是否可以使用后再次冷藏使用(斜面保藏法)?

答:请自行掌握。

31.大肠埃希菌镜检时,有时固定好的菌在染色过程中脱落,请问是什么原因引起这种情况?

答:首先,洗干净拨片,挑菌注意不要太多,待菌固定好后再进行染色。

32.生孢梭菌,菌落培养计数时一定要在厌氧条件下进行吗?

答:是

33.菌悬液怎样在24h内确定其菌落数?请讲解细菌和真菌的方法.

答:平板计数方法。

34.生孢梭菌培养时,怎样做才能使其在厌氧中培养?

答:详见2010版药典

35.菌种的纯度鉴定包括哪些内容?如果是跟省药检所买的3代菌是否就不用做纯度或确认试验?

答:省所现在销售的是第二代的甘油冷冻管,严格来说,请做纯度确认。

36.为什么有时候细菌管会长真菌,而真菌管也会长细菌。

答:原因可能是多方面的,某些细菌适宜在真菌培养基上生长,而某些真菌也能在细菌培养基上生长。比如2010版药典无菌检查法,两种培养基的使用范围已删去,已不是绝对的细菌培养基或真菌培养基。

37.在做方法验证时,黑曲霉菌浓度大于20cfu/皿时,培养5天后菌落蔓延扩散,无法各个区分,如何在药典要求的50~100cfu和实际操作结果中找到平衡?因为菌浓对回收率及操作RSD%影响很多.

答:培养48-72h后,菌落刚形成时,及时点计并做记号,然后每天观察有无新的菌落长出并计数。

38.标准菌黑曲霉在传代前需要先接到改良马丁培养基复苏后,再传代,如果需要,接到改良马丁培养基后培养时间怎么定?

答:2010版药典规定 ,黑曲霉传代,培养时间为5~7天

39.有时候在玫瑰红钠琼脂或营养琼脂平板上生长有酵母菌,在酵母菌生长的位置底部产生了一个气泡状的圆形,把底部的琼脂都贡起来了,又或者表面没有任何菌落,而琼脂被贡起来,请问这种圆形气泡是菌吗?在计数时是否也把它算入酵母菌?

答:建议挑取气泡内含物接种至改良马丁琼脂培养基中,若能生长,且为酵母菌的菌落形态,应该可以将其算入酵母菌。

40.大肠生化实验中的靛基质试验(I)项结果为“ ”或者“-”均不影响最终结果的判断,请问该项的意义何在?是否可以取消?

答:反应为 ,为典型大肠埃希氏菌,-为非典型大肠埃希菌。关系到最终判断,都是必须的实验,不可取消。

41.生化检查用的鉴定盒是否需要跟培养基一样做适用性检查?如果需要做,应该如何进行?

答:用阳性菌做一次,实验结果相符即可。

42.铜绿假单胞菌用什么方法保存及更活处理方法?

答:建议采用甘油冻存管(终浓度为20%的甘油冻存管),-30℃(或更低温度)保存。

43.工作菌种每代可保存多长时间(斜面低温保藏法)才传下一代?

答:教科书上的保存时间为1-6个月。

44.工作菌株的使用记录(时间、用途、使用者等)是否需要建立台账?

答:是

45.菌株的纯度和特性要多久确认一次,最短时间和最长时间分别是多少?

答:做标准储备菌株之前务必要进行鉴定,其它根据实际情况:如污染、活性下降、储存条件发上改变等。

46.革兰氏染色前,菌落是否要先纯化(接到营养琼脂斜面上)还是直接从选择性培养基上挑起菌落直接染色?

答:要纯化,从选择性培养基挑取单个菌落,最好先接到营养琼脂斜面后,再进行染色。

47.真菌接至改良马丁液体培养基中,培养时间为多长?(白色念珠菌、黑曲霉)答:见2010版药典。

48.菌种鉴定一定要做到生化鉴定吗?

答:要。可以选择传统的生化试验鉴定,也可选择鉴定仪或鉴定试剂条。请视自身情况而定。

49.是否可按10版药典中抑制控制菌检验判定方法进行?比如金葡菌做甘露醇平板分离,革兰染色,血浆凝固酶为阳性就可以了。

答:金葡这样做可以。其他菌株视具体情况而选择适宜的鉴定试验。

50.请介绍一下,有什么简便的方法灭菌甘油?

答:高压湿热灭菌法

51.黑曲霉孢子悬液贮存期验证怎么做。‘

答:请参考前面该问题的答复。

52.铜绿假单胞菌琼脂斜面变红,是否会造成菌种变异?如何避免该情况出现?(本菌株于25℃保存)

答:出现这样的情况建议对菌种纯度进行鉴定。实验操作请注意防止污染。

53.铜绿假单胞菌菌悬液是否也可在2~8℃保存,24小时内使用?

答:不建议,请自己验证。

54.是否一定要使用CMCC的菌株吗?

答:药典是这样规定的。

55.假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以吗?

答:请按药典规定来进行实验,若是药品检验,请用CMCC菌株。

56.可以用液氮保藏甘油冷冻管吗?可以的话应该怎么操作?

答:可以。具体操作不清楚。我们没有液氮保存罐。

57.贵所有开展支原体检查法这个实验吗?

答:没有

58.制备菌悬液的时候,培养物用的营养肉汤用量是多少?

答:没有具体规定,请自行制定。

59.制备菌悬液的时候怎样保证他是50cfu呢?具体说一下操作方法

答:自行摸索一套方法,固定下来,以后就按该方法做就可以了。

60.请问菌种斜面最好多长时间转接一次?

答:参考上一题。

61.20%甘油v∕v是用水还是用相应培养基做稀释?

答:用相应的培养基。

62.验证或做培养基的适用性检查时,若实际操作制得的菌悬液,经测定计数后不在规定的范围内,如>100cfu,是否应判本次实验无效,应重试?若试菌,真菌生长较慢,不能短期内预算菌数,如何解决?

答:第一个问题,请重试。第二个问题,请注意积累平时实验经验,标准化操作,慢慢摸索稀释的倍数。

63.有时候酵母菌在玫瑰红钠平板上不易观察,是否可用孟加拉琼脂培养基代替来作培养?

答:药品检验请严格按药典规定,若是平时科研,应该可以用孟加拉红琼脂培养基代替。

64.菌种的每一次传代(如3代→4代→5代)都必须做菌种鉴定实验吗?

答:视具体情况而定。

65.如何控制菌液的浓度为50~100cfu/ml?

答:见前面问题的回复。

66.菌种的传代,营养肉汤或改良马丁0.5ml~0.8ml复苏冻干菌粉→直接涂布于营养琼脂培养基或改良马丁琼脂培养箱→是第一代还是第二代?

答:冻干菌粉为第0代,若冻干菌粉未经过培养,直接涂布到培养基上,为第1代。

67.请教一个有关微生物限度检查的问题,在制备10~100cfu菌液时除了你说的比浊法,比较普遍的就是平板计数法,而其中用到的六种试验菌,细菌用营养琼脂计数,霉菌用玫瑰红钠琼脂平板计数,其它四种菌应用何种培养基计数?

答:不知道此处所说的其他4种指的是什么菌。

68.只用平板计数,结果准确吗?还有没有其他方法制备10~100cfu菌悬液?答:这是一个很好的课题,若感兴趣,你们可以好好研究一下。

69.大肠埃希菌检查中,MUG培养基配制后显荧光是什么原因?

答:有可能试管玻璃材质自发荧光,也可能清洗不干净,或培养基本身质量,比如有无发生污染等。

70.请问可用何种培养基或手段鉴定枯草芽孢杆菌?eg:大肠埃希菌用EMB,金黄色葡萄球菌用甘露醇

答:目前尚未有合适的选择性培养来鉴定枯草芽孢杆菌,可选用API 或细菌鉴定仪等手段来鉴定。

71.请问:细菌鉴定仪有哪些用途?能够鉴定沙门菌属下的各种沙门菌么?怎样应用?

答:如有需要,可联系梅里埃的技术支持人员:13503006367 霍工。他会详细解答你想问的问题。

72.黑曲霉菌在2~8℃保存经验证后能否延长使用时间?

答:药典规定在验证过的期限内使用。

73菌种的保藏可否用液体石蜡保藏?与甘油冷冻保藏有何区别?

答:药典未记载液体石蜡保藏法,部分参考书记载斜面保藏法或半固定保藏法可加灭菌石蜡覆盖。

  

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