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分子印迹示意图
分子印迹技术研究进展
摘要 分子印迹技术是近年来集高分子合成、分子设计、分子识别、仿生生物工程等众多学科优势发展起来的一门边缘学科分支。分子印迹聚合物由于具有与天然抗体同样的识别性能力和与高分子同样的抗腐蚀性能的双重优点,因而广泛应用生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域。本文就分子印迹技术的基本原理、基本方法、发展趋势、研究成果及应用前景进行了综述。
关键词 分子印迹 模拟酶 手性拆分 敏感材料 固定相层析
The Development of Research in Molecular ImprintingTechnique
Abstract Molecular imprinting technique(MIT) is an emerging interdisciplinary methodology that isdeveloping in recent years by utilizing the advantages ofmacromolecular synthesic, molecular design, molecular recognitionand bio-mimic bioengineering. Molecular imprinted polymers (MIPs)exhibit both advantages of highly stero- and enantio-selectiverecognition and strong resistance against corrosion.Therefore, MIPsare used extensively in biotechnology, clinicalmedicine,environmental monitoring,food industries etc.In thispaper, the essential theories, methods, development tendency,achievements and prospect of molecular imprinting technique arereviewed.
Key words molecular imprinting; mimicenzyme; resolution of racemates; sensitive substances; solidphase extraction
1 前言：
40年代,Pauling[1]试图用锁匙理论解释免疫体系。虽然他的理论经后人的实践证明是错误的,但是在他的这种错误的理论中仍有两点是正确的:(1)生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合位点; (2)生物体所释放的物质与外来物质在空间上相互匹配。正是基于这两点,化学家们发展了一项有效的分析技术称为分子印迹技术(molecularimprinting, MIP) ,在国内也有人把它称为“分子烙印”[2]。
1949年,Dickey[3]首先提出了“分子印迹”这一概念,但在很长一段时间内没有引起人们的重视。直到1972年由Wulff[4]研究小组首次报道了人工合成的有机分子印迹聚合物之后,这项技术才逐渐为人们所认识, 并于近10 年内得到了飞速的发展。迄今,在印迹机理、制备方法以及在各个领域的应用研究都取得了很大的进展,尤其是在分析化学方面的应用更是令人瞩目。在此期间,有关分子印迹技术的文章大量涌现,仅最近3—4年间在各种刊物上共发表有关分子印迹方面的文章就有600余篇[24-36],可以说整个研究工作正处于欣欣向荣的阶段。分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常广泛,包括环境、医药、食品、军事等[4-11]。分子印迹技术的主要研究工作主要集中在瑞典、德国、日本和美国。我国从事这一方向的研究还不到10年,可以说刚刚起步。本文就分子印迹技术的概念、机理、制备方法及其应用研究的现状作一介绍。
2分子印迹技术的基本原理和方法
2.1分子印迹技术的基本概念和原理
分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。它是通过以下方法实现的: (1)首先以具有适当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体2模板分子复合物;(2) 选择适当的交联剂将功能单体互相交联起来形成共聚合物,从而使功能单体上的功能基在空间排列和空间定向上固定下来;(3)通过一定的方法把模板分子脱去。这样就在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配,并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴(如图)。这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结合,即对模板分子具有专一性识别作用。
这个三维空穴的空间结构和功能单体的种类是由模板分子的结构和性质所决定的。由于用不同的模板分子制备的分子印迹聚合物具有不同的结构和性质,所以一种印迹聚合物只能与一种分子结合,也就是说印迹聚合物对该分子具有选择性结合作用。迄今报道过的绝大多数工作都获得了较高的选择性。这也是分子印迹聚合物最大的优点之所在。一个理想的分子印迹聚合物应具备以下性质:
(1)具有适当的刚性,聚合物在脱去模板分子后仍能保持空穴原来的形状和大小。
(2)具有一定的柔性,使底物与空穴的结合能快速达到平衡。柔性对于分子印迹聚合物模拟酶来说尤其具有重要意义。
(3)具有一定的机械稳定性, 这一点对于高效液相色谱(HPLC) 尤为重要。
(4)具有热稳定性, 使其能在较高温度环境下使用, 因为对于一般的反应来说,温度较高使动力学上更有利。
2.2 分子印迹技术的分类
按照单体与模板分子结合方式的不同, 分子印迹技术又可分为分子自组装(self2assem bling)和分子预组织(preorganization)。两者的主要区别在于单体与模板分子结合的机理不同:分子自组装是指单体和模板分子之间是通过弱的相互作用力(如静电力、疏水作用力、氢键及金属配位健等)形成单体2模板分子复合物,而且是在溶液中自发形成的。分子自组装研究工作的代表是瑞典的Mosbach;以德国的Wulff 和美国的Shea为主的研究小组则是通过单体和模板分子之间形成可逆性共价键来合成单体2模板分子复合物的,这就是分子预组织。Vulfson[12]等人又发展了一种称之为“牺牲空间法(sacrificial spacer method)”的分子印迹技术。该法实际上是把分子自组装和分子预组织两种方法结合起来形成的方法,其制备过程如图 所示。
首先,模板分子与功能单体以共价键的形式形成模板分子的衍生物(单体2模板分子复合物), 这一步相当于分子预组织过程, 然后交联聚合,使功能基固定在聚合物链上, 除去模板分子后,功能基留在空穴中。当模板分子重新进入空穴中时,模板分子与功能单体上的功能基不是以共价键结合, 而是以非共价键结合,如同分子自组装。Piletsky[13]等人也发展了一种分子自组装和分子预组织相结合的方法:其分子印迹聚合物硅酸受体以烯丙基胺(allyl am ine )和乙烯基苯基硼酸(vinylphenylbo ronic acid) 为功能单体,甲基丙烯酸乙撑酯为交联剂。首先使硅酸和乙烯基苯基硼酸发生酯化反应,形成功能单体12模板分子复合物,然后该复合物与另一功能单体烯丙基胺自发形成单体12模板分子2单体2复合物, 加交联剂后发生共聚合反应形成硅酸分子印迹聚合物,最后脱去硅酸。当硅酸分子重新进入聚合物空穴后,两种功能单体都以非共价键与硅酸分子结合。上述两种方法虽然可以克服在同一聚合物中同时使用两种功能单体时存在的困难,但都不可避免预组织方法所存在的化学合成的困难。
2.3分子印迹聚合物的选择性和亲和性机理及影响因素
关于分子印迹机理方面的研究已相当深入。一般认为分子印迹聚合物对模板分子的识别主要是由三个方面的因素决定的。
(1)分子印迹聚合物中功能单体上功能基与模板分子上功能基的选择性反应(印迹反应)
①印迹反应
a) 形成可逆性共价键的反应;
b) 形成非共价键(包括氢键、离子键、金属配位键、P2P作用力、疏水作用力和范德华作用力) 的反应。
②影响因素
凡是能影响这些反应发生的因素都能影响分子印迹聚合物对模板分子的识别作用。这些因素有:
a)功能基的抑制剂
即能与功能基发生反应的物质,该抑制剂与功能基发生反应后不仅使功能基丧失活性,而且占据了空穴的空间, 使模板分子不能与功能基结合。
b)功能基空间取向的改变
某些物质和条件,如溶剂和温度等可以使功能基的空间取向发生改变。不论是形成共价键还是形成非共价键的反应都有一定的方向性,如功能基的空间取向和模板分子功能基的空间取向不匹配,则会明显影响两者的结合强度和结合速度,甚至会使反应不能发生。[14]
c)静电斥力和空间位阻效应
分子印迹聚合物是一种高度交联的共聚物,其聚合物链以及链上存在的其它基团等都可以阻碍模板分子和聚合物功能基发生印迹反应,使聚合物选择性和亲和性降低甚至丧失。
d)溶剂的影响
溶剂的某些性质对印迹反应的发生有很大的影响,如溶剂的极性、介电常数、质子化作用及络合作用等。这些因素是通过对聚合物和底物的分子作用来影响两者之间的选择性和亲和力的。溶剂对聚合物的影响可归于上述第一种情况:功能基的抑制剂。溶剂对底物的影响是通过形成氢键等弱的相互作用,使底物与功能基的反应活性受到影响。这对分子自组装方法的影响尤其大。因为分子自组装就是通过这些弱的相互作用实现的,底物分子一旦与溶剂形成氢键或其他类型的键,就很难再与聚合物功能基发生作用。所以自组装分子印迹聚合物的制备都是在非极性有机溶剂中进行的。但最近关于用水作为溶剂的分子印迹技术已有了突破性的进展。在这些研究中,虽然还不能在水相中制备分子印迹聚合物,但印迹聚合物已能在水相中识别底物。这一点至少可以表明在水相中是可以发生印迹反应的。实验证明:作用位点的数量,以及聚合物能与模板分子发生作用的功能基的个数对印迹聚合物的选择性和亲和力有很大的影响。通常,作用位点越多,聚合物对底物的选择性和亲和力也越高。功能基的数量一般是由模板分子上功能基的数量决定的,这方面的研究还很少。尽管专一性结合位点的数量对印迹聚合物的选择性和亲和力的重大作用已得到大量实验事实的支持,但近来Mosbach 研究小组在研究印迹聚合物对肽链的亲和性时,对印迹机理提出了新的理论。该理论认为:分子印迹聚合物对底物的选择性和亲和力不仅是因为印迹聚合物中有可以与底物进行专一反应的结合位点,更为重要的是功能单体在印迹聚合物上形成了高度有序的结构,这种高度有序的结构与离子或(和)疏水作用力一起对印迹聚合物的选择性和亲和性起主要作用。目前看来该理论的实验证据还不充分,他们只研究了生物高分子的印迹行为,没有进行小分子的研究。生物高分子和小分子有许多不同的化学和物理性质。
(2)分子印迹聚合物空穴的空间结构与模板分子的构型、构象的完美匹配
分子印迹聚合物空穴的空间结构与模板分子的构型、构象的完美匹配有利于印迹聚合物功能基与模板分子功能基的充分靠近并进行专一性结合。聚合物空穴的结构和形状并不是完全刚性和一成不变的。实际上在溶剂中,不论是通过分子自组装还是通过分子预组织方法制备的分子印迹聚合物都存在溶胀现象。这使得印迹聚合物空穴的大小和形状都发生改变,从而使选择性和亲和力发生不同程度的改。实验证明:聚合物构象的改变是通过溶剂作用于聚合物链而引起的。这种构象的改变可以通过测定聚合物与模板分子结合前后的旋光性的改变而直接检测出来[15]。聚合物的溶胀对于以分子自组装和分子预组织方法制备的聚合物的影响是不同的:对于以分子预组织方法制备的聚合物来说,除去模板分子的聚合物在溶剂中会发生溶胀,但当聚 合物重新与模板分子结合后,聚合物的体积由于功能基与模板分子的反应而减小,甚至减小到原来的体积。这说明:预组织分子印迹聚合物功能基与模板分子之间的作用力强于溶剂与聚合物链的作用力;而对于分子自组装方法制备的印迹聚合物来说,则不存在这种体积减小的现象。这说明:功能基与模板分子之间的作用力弱于或最多等于溶剂与聚合物链之间的作用力。这也可以作为溶剂对分子自组装比对于分子预组织方法影响较大的直接证据之一。一般来说,功能基与模板分子之间的专一性反应在聚合物对底物的选择性亲和过程中所起的作用是主要的。分子印迹聚合物在用于对映体的拆分时,存在一种这样的现象:以一种物质作为模板分子制备的印迹聚合物可以用于另一种物质对映体的拆分,反之亦然。这种现象被称之为交叉选择性。如以D2果糖或D2半乳糖为模板分子制备的分子印迹聚合物,当底物中存在其原模板分子时, 聚合物优先和它的模板分子结合,这是很自然的,但以D2果糖为模板分子制备的印迹聚合物在混合底物中却能优先结合L2半乳糖;而以D2半乳糖作为模板分子制备的印迹聚合物也可以在混合底物中与L2果糖优先结合。存在这种现象主要是因为可以发生交叉反应的分子(D2果糖和L2半乳糖, D2半乳糖和L 2果糖) 之间功能基的排列是一样的,所不同的只是羟甲基的伸展方向。从这一现象也可以看出模板分子与分子印迹聚合物通过功能基的专一性结合对于聚合物的选择性和亲和性起了主要作用。但除此之外,对于大多数功能基排列相同的底物之间的识别则主要是由空穴的大小和形状起决定作用的。总的来说功能基和聚合物空穴对于聚合物的选择性和亲和力共同在起作用,缺一不可。
(3)印迹聚合物对底物分子的识别过程
不论是印迹聚合物被用于催化还是被用于分离或其它目的,被选择底物是否能正确进入聚合物空穴都是很重要的。对于一个有两个结合位点的空穴来说,模板分子进入空穴并与功能基结合有以下两种情况如图3 所示:
①首先通过单位点结合, 然后通过模板分子的移动使两个位点都发生反应,这是最为理想的情况。
②单位点结合以后, 由于空间的关系,通过模板分子的移动无法形成正确的两位点结合。这个模板分子如想形成正确的两位点结合就必须断裂已结合的键。事实上,两位点结合的结合常数大于单位点结合的结合常数,所以说大多数底物分子都能以正确的方式进入空穴并与功能基结合。这可能是由于聚合物链之间的空隙和空穴的形状已对底物分子进行了初步的定向和筛选。但是,两位点结合的速度却慢。
实验证明, 升高温度可以大幅度提高聚合物对底物的选择性,这可能是由于:
①在较高温度下发生两点结合的速度提高;
②在较高温度下分子运动加剧, 单位点结合的底物可以较快地落下来,继而形成正确的双位点结合的形式;
③温度升高, 使聚合物更加膨胀,那些在室温下不能被利用的空穴由于聚合物的膨胀而得以被利用。对于同一个聚合物来说,不同空穴的选择能力是不同的,他们对于聚合物选择性的贡献也是不同的。[16]这是由于聚合物中空穴及功能基与底物的匹配程度不同所造成的。许多实验证明:尽管印迹聚合物对于原模板分子的专一性结合占绝对优势,但由于功能单体在聚合过程中,有相当一部分没有与模板分子结合的功能基存在于聚合物表面,这些功能基可以和其它分子结合(一般称这类结合为非特异性结合) ,聚合物空穴中的功能基也可以进行这种非特异性结合。另外聚合物链上还存在的一些其它基团也可以和其它分子结合。这样聚合物在特异地与模板分子结合的同时还可以非特异地结合其它分子,从而造成对模板分子的选择性降低,对于色谱分析来说会造成峰的“拖尾”现象;[17]而对于用作传感器敏感材料来说,则会造成干扰或误检。McNiven等人通过用碘仿等试剂处理印迹聚合物,在保护特异性结合位点的同时抑制非特异性结合反应,从而获得了较高的选择性。[18]
3.分子印迹技术的应用
运用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物具有多方面的应用。下面就目前的应用研究情况作一介绍。
3.1 分子印迹技术用于色谱分析
分子印迹聚合物用于色谱分析主要有以下两方面的工作:样品前处理(分离、提纯、浓缩) 和手性物质的分离。
(1) 样品前处理
分子印迹聚合物作为吸附剂,真正用于试样的前处理是Sellergren[19]1994年首先报道的以他合成的五咪(pen tam idin, 一种抗原虫菌药)为模板的印迹聚合物,该聚合物作为吸附剂完成了对生物液体试样尿中五咪的提取、纯化和浓缩,使之达到能够被直接检出的浓度。Martin[20]等人指出了印迹聚合物作为固定相时存在的困难:①印迹聚合物具有很大程度的非专一性吸附,这对分离工作十分不利。虽然他们通过加TEA 等离子修饰物克服了这一困难,但洗脱条件控制严格, 给应用带来了许多不便。②回收率不能到100% ,而且回收率不能控制在一个准确值, 从而影响定量分析,特别是痕量分析工作的准确性。最近Zander[21]等人报道了他们的最新工作, 他们以尼古丁作为模板制备的分子印迹聚合物,在分析口香糖中所含的尼古丁及尼古丁氧化物时得到了非常高的回收率和良好的重现性。他们制备的聚合物在选择性上明显优于传统的C18吸附剂和没有印迹反应的同种聚合物。而且他们的报道中没有显示任何可检出的模板残留。迄今为止,分子印迹技术结合固定相色谱对分析样品进行前处理的研究已作了很多工作。目前的研究表明分子印迹聚合物2固定相色谱完全能运用于分析试样的分离、纯化和浓缩工作。但这方面的研究仍处于初级阶段,尚有许多不完善的地方。许多研究表明分子印迹聚合物可以从有机溶剂和水中选择吸附分析底物。但是,对于不同物质, 不同的溶剂(极性、非极性)其吸附条件和洗脱条件都是十分不同的, 尚没有发现一个普适规律,从这一点上讲尚不如传统的吸附剂。所以仍需大量的研究工作,以找到这种规律。其二, 虽然目前的研究工作涉及领域广, 化合物种类多,但大多数工作都集中在分离方法的建立,而对分离机制的研究尚不足。事实上分离机制是所有应用研究的理论基础,是十分重要的一环。目前分子印迹技术在色谱分析中存在的问题,都应归结为对基础理论研究的不足。其三,对于解决模板分子在印迹聚合物中残留这一问题也将成为今后研究的一个重点,因为这一问题的存在已严重阻碍了分子印迹聚合物在色谱分析中的应用,特别对于痕量分析。总之今后的工作将呈现理论研究与应用研究并重的发展势态。
(2)用于手性拆分
大多数手性拆分的工作都集中在药物手性分子的拆分上。近来,分子印迹手性拆分工作进展迅速,而且其拆分方法已不仅限于HPLC。所研究的拆分对象包括药物、氨基酸及衍生物、肽及有机酸。下表列出了一些具代表性的工作。
(3)分子印迹聚合物色谱分析存在的不足
①目前该工作存在的主要不足是聚合物容量太小。这主要是因为聚合物中实际有效结合位点太少所致。Sellergren等人虽然通过自组装和预组织结合的方法, 提高聚合物容量,但这一方法因其需要模板分子能发生可逆共价键反应,因而限制了它的广泛应用。
②分子印迹聚合物在制备前首先需要纯的对映体分子,这就给一些用一般方法难以拆分的消旋物的拆分工作带来了困难。理论上讲可以用分子类似物作模板,实际上分子类似物寻找也是一件非常困难的工作。Mosbach等人建议用经部分拆对映体做模板进行逐步的拆分,可以想见其工作是繁琐的。
③虽然已有报道在水相中进行了手性拆分, 但也都是处于刚刚开始阶段,尚有待进一步去研究。总之, 目前虽有不少问题有待解决,但分子印迹聚合物用于手性拆分的前景是不容否定的。
3.2分子印迹聚合物用作传感器敏感材料
分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研究向。我们把这种以分子印迹聚合物作为敏感材料的传感器简称为分子印迹聚合物传感器。分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比,具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂, 不易被生物降解破坏,可多次重复使用, 易于保存等优点。而且, 较生物材料易得,可以用标准的化学方法合成出来。因此,分子印迹聚合物有希望成为取代生物材料的理想替代品。自1987 年Tabushi首次用分子印迹聚合物作为敏感材料, 对维生素K1、K2、和E进行了测定以来, 分子印迹聚合物传感器引起了人们极大的兴趣,在国外已成为传感器研究领域的一个新热点。
3.3 抗体和受体模拟物
用分子印迹聚合物制备人工抗体和受体,从理论上来说是对生物抗体的一种有益的补充,其前景是非常诱人的。在过去的几年中, 许多研究证明,分子印迹聚合物可以用作制备人工抗体,可以作为免疫实验的识别物质。事实上,许多分子印迹聚合物的吸附实验都是基于竞争性放射配体结合这一原理的。如以茶碱和镇静剂为模板的印迹聚合物显示了惊人的专一性识别能力。当这些印迹聚合物被用于竞争性实验时,对于结构相近的物质的结合能力或者完全没有,或者远低于与模板分子的结合能力。抗茶碱印迹聚合物完全能够区分印迹分子和结构上非常相似的咖啡因,而茶碱和咖啡因化学结构上只有一个甲基的差别,用一般的方法是很难把两者区分开的。更惊人的是这些分子印迹聚合物的交叉反应与这些药物的单克隆抗体的交叉反应几乎是相同的。抗茶碱分子印迹聚合物用于检测病人血浆样品中茶碱的含量是完全符合医学检测要求的。这证明印迹聚合物抗体和受体完全可以作为生物抗体的理想替代品和有益的补充。Andersson等人成功地制备了morphine 和Leuenkephalin 印迹聚合物,该聚合物可以作为人工opioid受体。这些抗吗啡印迹聚合物不仅能在有机溶剂中,而且能有效地在水相中完成识别过程, 只是在水相中, 检测限下降了10倍。但这种印迹聚合物仍然可以用于要求不太高的实验中,如药物筛选等。
分子印迹聚合物作为人工抗体和受体有以下几点好处:
(1) 制备容易;
(2) 稳定性好, 适用于苛刻环境如高温、高压、强酸强碱及有机溶剂;
(3) 对于从自然界难得到或不能得到的抗体和受体,人工制备的模拟物则成为生物抗体和受体有用的补充;
(4) 造价低廉;
(5) 不需要大量动物;
(6) 不易受到生物降解的破坏。
总之, 分子印迹聚合物完全可以成为生物抗体和受体的理想替代品,从目前的工作来看, 如能扩展研究范围, 可望得到更大的应用。
4 展 望
随着分子印迹技术研究的不断深入和应用领域的不断扩展,使人们越来越清楚地看到分子印迹技术具有广阔的应用前景和深刻的理论意义。如模拟酶的研究远不止制备酶本身,更重要的是通过模拟酶的研究, 可以发现酶催化的机理,从而认识生命自身的化学和生物学过程, 继而有助于解决诸如寿命的延长,疾病的防治等一系列重大问题。迄今为止,分子印迹聚合物的制备大多集中在小分子化合物上,对于生物大分子化合物如蛋白、糖蛋白,甚至整个细胞的研究进行得尚少。生物大分子不仅结构比较庞大,而且其本身的物理化学性质也有其独特之处,这对传统的聚合方法等都提出了挑战,比较看来表面印迹方法似乎更适合于生物大分子。另一方面对于气态小分子的研究也很少有人尝试过。这可能是因为气体分子本身体积太小,常温时呈气体,操作中无法控制等原因所致。印迹聚合物在水相中的制备和识别是历来存在的问题,这也是分子印迹聚合物模拟酶、抗体等与生物酶、生物抗体相比存在的不足之处。现在已有突破性进展,可以在水相中识别底物[22]。而且许多研究人员、研究小组都在致力于解决这一问题,期望在不远的将来, 不仅能在水相中识别,而且可以在水相中制备。在所报道的事实中, 用于气相中识别的研究也
很少。随着研究的深入和生产实践的需要,气相中的识别也将会成为分子印迹技术研究的重要方向。分子印迹聚合物本身范畴也在不断扩展,印迹聚合物的制备已不仅限于通过化学合成,而且可以直接用生物大分子如蛋白质来制备[23],可以想见还会有其他新的方法不断涌现出来。分子印迹技术给我们带来了希望,同时也带来了挑战, 挑战我们的智慧,挑战我们的科学奉献精神。相信只要我们孜孜以求,一定会取得令人振奋的成功。
