爱华网中国组织工程研究 第21卷 第8期 2017–03–18出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 18, 2017 Vol.21, No.8
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常山酮阻止早期骨性关节炎的关节软骨退变
·研究原著·
李 蛟，胥伯勇，郭文涛，穆文博，张振东，纪保超，曹 力(新疆医科大学第一附属医院关节外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000) 引用本文：李蛟，胥伯勇，郭文涛，穆文博，张振东，纪保超，曹力. 常山酮阻止早期骨性关节炎的关节软骨退变[J].中国组织工程研
究，2017，21(8):1167-1171.
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.004 ORCID: 0000-0001-9521-149X(李蛟)
文章快速阅读：
文题释义：
常山酮：是一种生物碱，是中药有效成分常山碱的衍生物，其分子式是 C16H17BrCIN3O3 ?HBr，为白色或淡灰色结晶性粉末，无臭，味苦。关于常山酮的研究已经有数十年了，很长一段时间其一直作为广谱抗球虫药使用。近年来，随着对常山酮的深入研究，发现常山酮可促进伤口修复、抑制组织纤维化 。
透明软骨：分布较广，成体的关节软骨、肋软骨及呼吸道的一些软骨均属这种软骨。新鲜时呈半透明状，较脆，易折断。透明软骨间质中的纤维为胶原原纤维，含量较少，基质较丰富。陷窝周围有一层含硫酸软骨素较多的基质，称软骨囊(cartilage capsule)，染色时呈强嗜碱性。软骨细胞在软骨内的分布有一定规律，靠近软骨膜的软骨细胞较幼稚，体积小，呈扁圆形，单个分布；位于软骨中部的软骨细胞接近圆形，成群分布，每群有2-8个细胞，它们是由一个细胞分裂增生而成，故称同源细胞群。
摘要
背景：研究证实，常山酮能够减弱骨性关节炎病程发展的进程。 目的：进一步验证常山酮对早期骨性关节炎的防治作用。
方法：健康C57BL6J雄性小鼠45只，随机分为3组，每组15只，假手术组只打开小鼠右膝关节囊不损伤其他部位，术后不做处理；其余小鼠均切断小鼠右膝前交叉韧带造骨性关节炎模型，安慰剂组造模后第3天开始给予蒸馏水灌胃每天1次；常山酮组造模后第3天开始按0.5 mg/kg剂量灌胃，每天1次，28 d后处死小鼠取右膝关节，做苏木精-伊红染色和番红固绿染色观察关节组织的形态和结构；免疫组织化学检测转化生长因子β1的表达量。
结果与结论：①组织学观察，假手术组关节软骨结构正常，潮线清晰，细胞排列整齐，未有软骨表面磨损痕迹；安慰剂组关节软骨层明显变薄，甚至部分损伤至潮线，软骨表面磨损严重并有碎裂现象，细胞排列紊乱；常山酮组软骨细胞分层较清晰且排列较整齐， 潮线清晰，细胞形态较规则；②3组透明软骨厚度假手术组 >山酮组>安慰剂组，钙化软骨厚度假手术组<常山酮组<安慰剂组，透明软骨厚度/钙化软骨假手术组>常山酮组>安慰剂组；③OARSI评分常山酮组显著低于安慰剂组，转化生长因子β1阳性细胞/软骨细胞值常山酮组显著低于安慰剂组，2项指标3 组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，常山酮灌胃能部分阻止小鼠早期骨性关节炎关节软骨退变，其作用机制可能是降低转化生长因子β1的表达，从而延缓骨性关节炎的进展。 关键词：
组织构建；软骨组织工程；常山酮；骨性关节炎；软骨细胞；关节软骨；透明软骨；钙化软骨；转化生长因子β1
主题词：
骨关节炎；软骨；转化生长因子β1；组织工程
基金资助：
新疆维吾尔自治区科技项目重大专项计划(201430123-3)
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 李蛟，男，1990年生，陕西省西乡县人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病的研究。
通讯作者：曹力，主任医师，新疆医科大学第一附属医院关节外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)08-01167-05 稿件接受：2016-11-18
Li Jiao, Studying for master’s degree, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 83000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Corresponding author: Cao Li, Chief physician, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 83000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
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Halofuginone delays articular cartilage degeneration in early osteoarthritis
Li Jiao, Xu Bo-yong, Guo Wen-tao, Mu Wen-bo, Zhang Zhen-dong, Ji Bao-chao, Cao Li (Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 83000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)
Abstract
BACKGROUND: Halofuginone has been proved to ameliorate the pathogenesis of osteoarthritis. OBJECTIVE: To further verify the protective effect of halofuginone on early osteoarthritis.
METHODS: Forty-five healthy male C57BL6J mice were randomly divided into three groups (n=15 per group): the mice in sham operation group were only subjected to right knee capsulotomy; in the other two groups, animal models of osteoarthritis were established by cutting off the right anterior cruciate ligament, followed by treated with distilled water (placebo group) or 0.5 mg/kg halofuginone (halofuginone group) via gavage, once daily beginning at 3 days after
modeling. Twenty-eight days after treatment, all mice were sacrificed and the right knee was removed. The morphology and structure of the joint tissue were observed by hematoxylin-eosin staining and safranin fast green staining; the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The structure of articular cartilage in the sham operation group was normal, the cells arranged in neat rows, and the articular surface was not worn. In the placebo group, the articular cartilage layer became thinner, the cartilage surface was worn and even fragmented, and cells arranged in disorder. In the halofuginone group, the cartilage cell layer was clear and tidy, with regular cell morphology. The hyaline cartilage thickness and hyaline cartilage thickness/calcified cartilage thickness were ranked as follows: sham operation group > halofuginone group > placebo group. The calcified cartilage thickness was the highest in the placebo group, followed by halofuginone group, and lowest in the sham operation group. Osteoarthritis Research Society International scores and TGF-β1 positive cells/chondrocytes in the halofuginone group were significantly lower than those in the placebo group, and all above indices showed significant differences among groups (P < 0.05). These results suggest that halofuginone via gavage can partially prevent articular cartilage degeneration in early osteoarthritis mice probably by downregulating the expression of TGF-β1, thus delaying the progression of osteoarthritis.
Subject headings: Osteoarthritis; Cartilage; Transforming Growth Factor beta1; Tissue Engineering
Funding: the Major Program of the Xinjiang Uygur Autonomous Region Science and Technology Project, No. 201430123-3
Cite this article: Li J, Xu BY, Guo WT, Mu WB, Zhang ZD, Ji BC, Cao L. Halofuginone delays articular cartilage degeneration in early osteoarthritis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(8):1167-1171.
0 引言 Introduction
全世界骨性关节炎患者大概有3.6亿人，而发病率为3.8%-38%，其中主要病变发生在膝关节，中国骨性关节炎患者人数估计超过1亿，有症状患者的占总人口的13%-34%[1-5]，而目前却没有治疗早期骨性关节炎的有效药物[6-7]，因此，常山酮治疗骨性关节炎的研究不但是必要的，而且将会给患者带来福音。
骨关节炎为一种退行性病变，由于年龄增大、肥胖、长期负重、创伤、关节先天性异常、关节畸形等很多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘骨赘生成和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等[8-10]。骨性关节炎最常累及膝关节和髋关节，轻者会有走路时感疼痛，久坐久站时觉关节僵硬，会引发骨质增生，导致关节肿大，内有渗液，急性肿胀时会有关节腔内出血，重者可引起失用性肌萎缩，甚至发生膝外翻或内翻畸形。髋关节屈曲内收，代偿性腰椎前凸，此时可有严重的下背部疼痛，不能行走，日常活动严重受限，甚至导致残疾[11]。
常山酮是中药有效成分常山碱的衍生物，长期以来作为广谱抗球虫药使用[12-14]。近年来，研究发现常山酮可抗炎、抗血管新生、抑制纤维母细胞活化、促进伤口修复、抑制组织纤维化等方面作用[15-18]。然而目前尚无常山酮防治骨性关节炎研究的报道。研究拟建立小鼠骨性关节炎损
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伤模型，观察不同处理组小鼠骨性关节炎损伤情况，检测小鼠胫骨平台软骨中转化生长因子β1表达情况，探讨常山酮在早期骨性关节炎防治中的作用，以及为研究常山酮防治骨性关节炎提供实验依据。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年6月在新疆医科大学第一附属医院科技楼完成。 1.3 材料
药物与试剂：常山酮购自沃森诺克公司，用蒸馏水按比例1∶100稀释至10 g/L分装在1.5 mL EP管中，冻存在-20 ℃冰箱中备用；番红O和固绿购自sigma公司；免疫组织化学染色试剂及DAB显色剂购自ROBOZ公司；光学显微镜购自奥林巴斯公司。
实验动物：C57BL/6J雄性小鼠45只，12周龄，体质量20-30 g， 购于南京大学动物模型实验室， 饲养于新疆医科大学第一附属医院动物模型实验室。 1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及处理 45只C57BL/6J小鼠 随机分为假手术组、安慰剂组、常山酮组， 每组15只。假手术组只打开小鼠右膝关节囊不损伤其他部位，术后不做处理；其余2组均为切断小鼠右膝前交叉韧带造模，安慰剂组给予蒸
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假手术组 安慰剂组 常山酮组
图1 小鼠膝关节组织学观察结果
Figure 1 Histological observations of the mouse knee joint
图注：图a-c为苏木精-伊红染色(×400)，常山酮组软骨基质着色较均匀，软骨细胞分层清晰有序，细胞形态较规则；d-f为番红-固绿染色(×200)，常山酮组软骨基质大部分染成红色，潮线明显，软骨表面有轻微磨损；g-i为免疫组织化学染色检测转化生长因子β1 表达(×400)，关节软骨阳性细胞表达较假手术组增多，阳性细胞染色也较深。
馏水灌胃；常山酮组按0.5 mg/kg剂量灌胃。蒸馏水和常山酮按照0.2 mL的体积每天灌药1次，连续灌胃28 d后处死。 1.4.2 苏木精-伊红染色 取下小鼠右膝关节置于40 g/L多聚甲醛固定24 h，10%EDTA-2Na 溶液脱钙2周，石蜡包埋，作4 μm厚连续切片，取部分切片行常规苏木精-伊红染色，常规脱蜡，苏木精染色10 min，水洗，1%盐酸乙醇分色数秒，水洗返蓝，伊红染色1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。染色后测量透明软骨和钙化软骨的厚度，并得到透明软骨/钙化软骨的比值，根据比值判断软骨磨损的严重程度[19]。
1.4.3 番红-固绿染色 常规切片脱蜡至水，于0.2%固绿染5 min，1%醋酸10 s，1%番红染液中浸染10 min，水洗；体积分数95%乙醇分色数秒，水洗；复加番红染色2 min，水洗；风干；二甲苯透明；中性树胶封固。番红固绿染色观察关节组织的形态和结构；并作OARSI评分[19]。 1.4.4 免疫组织化学染色 按照免疫组织化学试剂盒说明进行染色。取切片置于多聚赖氨酸防脱处理的载玻片上，烤片过夜，切片脱蜡至水，体积分数3%H2O2冲洗10 min，TBST冲洗3次，每次5 min，0.4%胃蛋白酶液修复抗原活性，37 ℃修复25 min，TBST冲洗3次，每次5 min，滴加山羊血清封闭37 ℃修复25 min，滴加抗兔转化生长因子β1多克隆一抗抗体，4 ℃湿盒孵育过夜，常温放置1 h，TBST冲洗3次，每次5 min，滴加二抗，TBST冲洗3次，每次5 min，DAB显色，苏木精复染8 min，PBS返蓝，脱水透明，中性树胶封固。光镜下观察转化生长因子β1在关节软骨中的表达，并采用Biosens Digital Imaging System分析处理切片，选染色清晰切片同一放大倍数检测，每张切片随机选取5个视野，计算阳性细胞数量[20]。
1.5 主要观察指标 ①各组小鼠关节组织苏木精-伊红染色、番红-固绿染色结果；②各组小鼠关节组织转化生长因子β1免疫组织化学检测结果。
1.6 统计学分析 所有统计分析采用SPSS 22.0版统计
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软件进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P值< 0.05为差异有显著性意义。
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2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验选用小鼠45只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组小鼠关节组织苏木精-伊红染色结果 ①假手术组：关节软骨结构正常，细胞排列整齐，无裂隙；软骨基质着色均匀，呈粉红色，软骨细胞胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色；软骨细胞分3层，表层软骨细胞呈梭形，形似纤维细胞，其长轴呈水平排列；中间层软骨细胞呈圆形，排列无规律，“背靠背”现象较少；柱状细胞层软骨细胞呈柱状排列，与软骨表面垂直，细胞间质较多，可见潮线；软骨钙化层的细胞肥大；②安慰剂组：软骨染色不均匀，裂隙多，关节软骨层变薄，软骨有碎裂现象；软骨细胞克隆增殖，呈巢状；细胞排列紊乱，软骨内细胞密度不均一，部分区域细胞密度增加或减少，以表层和移行层显著；③常山酮组：软骨基质着色较均匀，软骨细胞分层清晰有序，细胞形态较规则，图1a-c；3组透明软骨、钙化软骨的厚度及透明软骨/钙化软骨值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。
2.3 各组小鼠关节组织番红-固绿染色结果 ①假手术组软骨基质绝大部分染成红色，软骨表面胶原纤维层染成绿色，软骨下骨皮质和骨小梁呈绿色，软骨与软骨下骨界限清楚，潮线清晰；②安慰剂组软骨番红染色较假手术组淡，阳性范围小，而固绿的染色范围增大，由表层和放射层向中间延伸，软骨表面的模样结构被破坏，可见软骨基质中糖胺聚糖含量减少，纤维成分增多；③常山酮组软骨基质大部分染成红色，潮线明显，软骨表面有轻微磨损，见图1d-f。3组OARSI评分比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表
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表1 各组小鼠关节胫骨平台的透明软骨厚度、钙化软骨厚度及透明
软骨/钙化软骨值比较 (x_
±s，n=15) Table 1
Comparison of the hyaline cartilage thickness, calcified cartilage thickness and hyaline cartilage thickness/calcified
cartilage thickness in the mouse tibial plateau among groups
组别 透明软骨(μm) 钙化软骨(μm) 透明软骨/钙化软骨 假手术组 712.3±144.6 487.1±93.2 1.47±0.20 安慰剂组
508.5±107.8 664.4±131.0 0.77±0.13 常山酮组 609.3±118.0 507.2±92.1 1.20±0.09
F
10.36 12.36 83.58 P
< 0.05
< 0.05
< 0.05
2.4 各组小鼠关节组织转化生长因子β1免疫组织化学检测结果 假手术组关节软骨阳性细胞较少，染色较浅；安慰剂组关节软骨全层软骨细胞胞浆中均有棕黄色颗粒，细胞排列规则； 常山酮组关节软骨阳性细胞表达较假手术组增多，阳性细胞染色也较深，见图1g-i。3组转化生长因子β1阳性细胞/软骨细胞值比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
3 讨论 Discussion
骨性关节炎的病因较多，是老年人最常见的一种关节疾病软骨细胞外基质的分解代谢增强是导致骨性关节炎关节软骨退变的主要病理过程。骨性关节炎的发生机制很复杂， 一般认为是多因素综合结果所致[21]。关节的稳定性是保持其正常结构和功能的一个重要因素，如果发生关节不稳，那么关节各结构的动态平衡将失调， 从而致导致关节发生退变。在继发性骨性关节炎中，关节应力改变是骨关节退变的重要原因。因此，采用使关节失稳或改变应力的方法可造成骨性关节炎模型。骨性关节炎动物实验模型的建立是研究骨性关节炎病理变化及防治的必要手段，由于小鼠的膝关节结构与人类的接近，而且小鼠骨性关节炎模型软骨的生化指标也与人类骨性关节炎一致， 所以相关实验多选用小鼠膝关节行骨性关节炎模型的制备， 为实验提供病理基础[22]。实验采用C57BL6J小鼠成功复制了骨性关节炎模型[23]。实验观察显示安慰剂组小鼠膝关节呈典型的骨性关节炎表现，组织学OARSI评分结果明显高于假手术组，表明造模成功。
3.1 常山酮 常山酮是一种生物碱，是中药有效成分常山碱的衍生物，其分子式是C16H17BrCIN3O3?HBr，为白色或淡灰色结晶性粉末，无臭，味苦。关于常山酮的研究已经有数十年了，很长一段时间其一直作为广谱抗球虫药使用。近年来，随着对常山酮的深入研究，发现常山酮可促进伤口修复、抑制组织纤维化 。
常山酮能够减弱骨性关节炎病程发展的进程[24]。具体来说，在实验中可以检测到番红O染色保留蛋白多糖和透明软骨厚度减少的区域在常山酮常山酮组比对照组明显要厚要多，这说明了常山酮组中透明软骨钙化为钙化软骨的
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表2 各组小鼠关节软骨OARSI评分、转化生长因子β1阳性细胞/
软骨细胞值比较 (x_
±s，n=15) Table 2 Comparison of the Osteoarthritis Research Society
International scores of the mouse articular cartilage and transforming growth factor-β1 positive cells/chondrocytes among groups
组别 OARSI评分 转化生长因子β1阳性细胞/软骨细胞 假手术组 0.50±0.19 0.054±0.013 安慰剂组 9.27±2.60 0.239±0.032 常山酮组 4.53±1.30 0.157±0.029 F 92.76 187.1 P
< 0.05
< 0.05
比例和进程都比对照组要少要慢[25]。OARSI评分在常山酮常山酮组相对于对照组要明显的低一些。常山酮治疗后，其通过一系列机制促使软骨下骨重塑[26]。最重要的是，关节软骨退变提示软骨下骨改变，有目标地改变早期的骨性关节炎中可能存在的损伤因子是一种有效的预防策略。
常山酮抑制骨性关节炎的进程是通过促进软骨下骨中的转化生长因子β激活和异常血管生成的方式用来预防性治疗骨性关节炎。
3.2 转化生长因子β1 生长因子是一组具有促进细胞生长、增殖和合成的蛋白质或多肽，对骨和软骨的形成与修复起调节作用。其中转化生长因子β1表现出多重生物学特性，是各种生长因子中促进软骨细胞增殖最有效的生长因子，对修复软骨损伤具有重要作用。在牛软骨细胞的培养中，转化生长因子β1加快了蛋白多糖的代谢，并刺激胶原和葡糖胺聚糖在兔关节软骨中的合成， 降低细胞外基质分的降解[27]。Aral等[28]用腺病毒介导将转化生长因子β1基因成功地转入人软骨样细胞株HCS-2/8，显著增加了软骨特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖核心蛋白的表达，并抑制基质金属蛋白酶3表达，说明转化生长因子β1可刺激软骨细胞增生，促进糖蛋白转化，增加软骨基质的合成，拮抗炎症因子，从而有利于软骨修复。有实验显示，转化生长因子β1不足够是骨性关节炎的致病重要因素之一[29]。不过，也有资料表明转化生长因子β1对软骨细胞可能具有双向调节作用[30]，一方面，它能促进未分化的和分化早期的软骨细胞 DNA复制，促进软骨细胞增殖并促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成；另一方面，对分化末期的软骨细胞，转化生长因子β1则抑制其分化并抑制软骨基质的合成。
作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者，实施为全体作者，评估为通讯作者。
利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。
伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为
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