爱华网中国组织工程研究 第21卷 第7期 2017–03–08出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 8, 2017 Vol.21, No.7
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基于影像学技术股骨头坏死病灶范围、血液供应与病理变化关系： 诊断性动物实验方案
傅维民，王本杰(大连大学附属中山医院，辽宁省大连市 116001)
·研究原著·
引用本文：傅维民，王本杰. 基于影像学技术股骨头坏死病灶范围、血液供应与病理变化关系：诊断性动物实验方案[J].中国组织工程
研究，2017，21(7):1086-1091.
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.07.019 ORCID: 0000-0003-1716-0409(王本杰)
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文题释义：
激素性股骨头坏死动物模型的建立：采用香港中文大学Qin等介绍的的方法，静脉注射一次低剂量的脂多糖(10 μg/kg)，之后以24 h为间隔给予肌肉注射3次高剂量的甲基强的松龙(20 mg/kg)，最后一次给药后6周能成功建立股骨头坏死的动物模型。该模型的特点是造模成功率高，模型死亡率低，已经被证实有较好的安全性和有效性。
股骨头标本的Micro-CT检测：可以使用微型CT对股骨头样本进行数据采集与三维重建，以获得矢状面、冠状面和横断面的组织结构，并可对股骨头坏死区进行构建，确定骨坏死体积。Micro-CT检测结合显微对比剂灌注能够评价股骨头内血供情况，明确股骨头内主干血管的分布、走行及供血范围。
摘要
背景：目前评价股骨头坏死病灶体积大小的影像学方法有基于X射线的Kerboul角、坏死指数，基于CT、MRI图像三维重建计算股骨头坏死体积等，但各方法的准确度报道不一，尚无一种被广泛接受；同时，并没有研究明确揭示骨坏死病变范围、程度与股骨头血供损害的直接联系。
目的：评估各种常用影像技术在不同时期骨坏死病灶评价中的准确性，尝试确立一种更加简便易用的骨坏死病灶临床计算方法。
方法：实验为诊断性动物体内实验，在中国大连，大连大学附属中山医院完成。制备激素性股骨头坏死犬模型，通过MRI、CT检查，结合Micro-CT离体标本检测对坏死股骨头病变进行精确评估，结合血管灌注造影及病理检测评价骨坏死发生范围、骨破坏程度与血供变化的关联；同时将结果与临床常用仅基于影像学的骨坏死分期分级标准相比较，以期验证此精确测量方法与传统方法的一致性。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规，并遵守《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。
结果与结论：课题拟建立针对骨坏死不同分期采用不同影像学技术测定以获得准确结果的新理念，将使不同技术能力的医疗机构能够应用获得的影像资料给出相对更准确的骨坏死评估结果，使骨坏死病变分期评价更准确，进而患者有望得到针对评估结果的标准化治疗方案。 关键词：
骨科植入物；人工关节；股骨头坏死；X射线片；MRI成像；CT； 主题词：
股骨头坏死；放射摄影术；体层摄影术，X线计算机；磁共振成像；组织工程 基金资助：
2015年辽宁省科学事业公益研究基金【辽财教便字2015(13)号】
Assessing the degree of necrotic femoral head, and association of blood supply with pathlogical changes: study protocol for a diagnostic animal trial
Fu Wei-min, Wang Ben-jie (Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China)
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P.O. Box 10002, Shenyang 傅维民，男，1982年生，汉族，2014年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨与关节创伤方面的研究。
通讯作者：王本杰，博士，副主任医师，大连大学附属中山医院，辽宁省大连市 116001
中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2017)07-01086-06 稿件接受： 2017-01-16
Fu Wei-min, M.D., Attending physician, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China
Corresponding author: Wang Ben-jie, M.D., Associate chief physician, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China
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傅维民，等. 基于影像学技术股骨头坏死病灶范围、血液供应与病理变化关系：诊断性动物实验方案 www.
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Abstract
BACKGROUND: The imaging methods of evaluating the volume of necrotic femoral head are based on Kerboul angle and necrosis index revealed on X-ray, as well as CT and MRI three-dimensional reconstruction, but the accuracy of each method is different, and none is widely accepted. Additionally, the association of the volum and degree of necrotic femoral head with the status of blood supply to the femoral head remain unclear.
OBJECTIVE: To evaluate the accuracy of each imaing method for assessing different stages of femoral head necrosis, and to confirm a convenient method used for measuring the volum of necrotic femoral head.
METHODS: This diagnostic in vivo animal trial was finished in the Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Liaoning Province, China. The canine models of steroid-induced necrosis of femoral head were prepared, and received CT and MRI examinations, followed by three-dimensional reconstruction combined with Micro-CT to make accurate
diagnosis; the degree of necrotic femoral head and its association with the status of blood supply were evaluated through angiography and histopathological examination. All above outcome measures were compared with the Association
Research Circulation Osseous to testify the consistency of this precise method with traditional methods. The experiment follows the national guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals, and “Consensus author guidelines on animal ethics and welfare” by the international Association for Veterinary Editors (IAVE). The article was prepared in accordance with the “Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments Guidelines” (ARRIVE Guidelines).
RESULTS AND CONCLUSION: The aim of the study is to obtain a accurate measurement method by detecting different stages of osteonecrosis using different imaging techniques, which enables surgeons make exact diagnosis and clinical stage of osteonecrosis, thus desiging standardized treatment program.
Subject headings: Femur Head Necrosis; Radiography; Tomography, X-ray Computed; Magnetic Resonance Imaging; Tissue Engineering
Funding: the Science Public Welfare Foundation of Liaoning Province in 2015, No. 2015(13)
Cite this article: Fu WM, Wang BJ. Assessing the degree of necrotic femoral head, and association of blood supply with pathlogical changes: study protocol for a diagnostic animal trial. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(7):1086-1091.
0 引言 Introduction
成人股骨头缺血性坏死目前仍是世界骨科界的一大顽症，其病因多样化、发病机制复杂、致残率高，层出不穷的治疗手段也蕴涵着其治疗尚难以达到理想疗效，仅能缓解症状、限制发展或延缓其骨性关节炎发生的时间，最终仍难免被迫实行股骨头或全髋关节置换，因此早期发现、早期诊断和早期治疗就显得尤为重要[1-2]。同时，股骨头缺血性坏死的治疗方案选择与坏死病灶部位及大小密切相关，术前对坏死病灶准确的评估将直接决定治疗效果优劣。
影像学检查以其不可替代的直观性和灵敏性，能发现病变股骨头的范围、部位和程度，为早期骨坏死病灶评估提供依据。股骨头坏死影像学评价分期体系包括X射线、CT及MRI。①X射线评估：X射线片可对关节面形态，关节间隙及骨结构进行观察，反映了骨小梁结构功能性改变，不过X射线片是对骨内矿物质含量的反映，而在股骨头缺血性坏死的早期阶段(Ⅰ期)没有骨的矿物质含量变化，因而不显示任何X射线表现，故X射线片对股骨头缺血性坏死的早期诊断意义不大；②CT评估：CT扫描显示骨坏死区内增生、硬化、碎裂和囊性变等，较常规X射线更为清晰，即能从立体形态上对病灶进行定位，因此对治疗方案有指导意义。但CT同样要等骨坏死的修复过程造成骨组织在X射线上的密度发生改变时才能做出诊断；而且CT扫描对股骨头整体宏观与髋关节的结构，特别是头臼关系的观察有些不足，横断面的扫描还会使平行于扫描层面的裂隙无法显示，并且CT扫描无法测量髋臼指数，沈通氏线等有关髋关节测量的数据；③MRI评价：MRI成像对股骨头坏死的诊断有很高的敏感性和特异性。由于MRI具备清楚的软组
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
织分辨能力，故能反映病变区域的组织学变化，无假阳性，其对股骨头缺血性坏死的早期诊断在临床症状出现前一段时间即可显示，而在X射线检查中尚属正常。
骨坏死的临床分期、股骨头塌陷的预测直至治疗方式的选择均决定于影像学评价的结果。上述3种检查方式是骨坏死临床评估的最常用方式，但其机制的不同决定了都存在一定局限性，当分别针对早期骨质矿化结构未发生改变，及当股骨头塌陷后骨质破坏严重时，采用一种技术进行病灶的评估，准确性将有较大的偏差。而且既往研究并没有明确揭示骨坏死病变部分、范围和程度与股骨头血供损害的直接联系。针对上述问题，结合前期课题组已完成的多项股骨头缺血性坏死临床及基础研究课题成果，本项目拟在骨坏死影像学的精确评估及坏死病灶范围与血供、病理变化等方面进行研究。
1 设计和方法 Study design and methods
1.1 实验设计 动物体内实验，诊断性实验。
1.2 实验完成地点 中国大连，大连大学附属中山医院骨科实验室。 1.3 研究目的
(1)评估X射线、CT、MRI等常用影像技术在不同时期骨坏死病灶评价中的准确性，建立针对骨坏死不同分期采用不同影像学技术测定以获得准确结果的新理念，同时将确立一种更加简便易用的骨坏死病灶临床计算方法。
(2)通过MRI、CT检查，结合Micro-CT离体标本检测对坏死股骨头病变进行精确评估，结合血管灌注造影及病理检测评价骨坏死发生范围、骨破坏程度与血供变化的关联。
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傅维民，等. 基于影像学技术股骨头坏死病灶范围、血液供应与病理变化关系：诊断性动物实验方案 www.
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同时与临床常用仅基于影像学的骨坏死分期分级标准相比较，验证精确测量方法与传统方法的一致性。
(3)研究结果可为临床MRI、CT重建骨坏死区域的准确与否提供参考和依据。进而使临床骨坏死病变分期评价更准确，患者则有望得到针对评估结果的标准化治疗方案。 1.4 动物的选择 选择8-12月龄的实验犬14只，体质量7-10 kg，雌雄不拘。所有动物身体健康，均无术区创伤、感染及其他全身疾病，骨关节正常、无畸形。执行《实验动物管理条例》和《实验动物许可管理办法》规定进行实验。
1.5 实验方法
1.5.1 动物模型制备 按Qin等[3]的方法制备激素性股骨头坏死犬模型：静脉注射一次低剂量的脂多糖(10 μg/kg)，之后以24 h为间隔给予肌肉注射3次高剂量的甲基强的松龙(20 mg/kg)。造模后次日即开始观察实验犬的精神、饮食及行走状态，最后一次给药后6周行髋部行X射线片、MRI，观察是否出现股骨头坏死及坏死程度，筛选出股骨头坏死的实验犬，并取2只动物行组织学检查，以证实股骨头坏死的动物模型建立成功。
1.5.2 传统方法评估骨坏死病灶范围 建模成功后第4，8，12，20周行X射线、MRI、CT检查，并按照临床常用方法进行骨坏死病灶范围评估，获得数据，并得到骨坏死分期。
ARCO分期系统(Association Research Circulation Osseous)[4]：见表1。
基于X射线的骨坏死评价方法(Kerboul法)[5]：以髋关节正、侧位X射线平片上坏死面的弧度之和(Kerboul结合角，图1)来评价骨坏死范围。该角度≥210°为大范围，<160°为小范围，> 210°预期病变进展不良。
1.5.3 基于CT、MRI图像计算机重建确定骨坏死体积 将DICOM格式的MRI、CT图像数据导入计算机，通过Mimics软件分析，确定MRI、CT下的骨坏死体积[6]。
MRI评估病灶[7-10]：①Kim法：测量正中冠状位图像上股骨头最大直径A，坏死部分长径长度A’，正中矢状位图像上股骨头最大直径B，坏死区长径B’，股骨头的坏死指数公式=(A’×B’/A×B) ×100%(图2)；②Koo法：测量正中冠状位图像上坏死部角A和正中矢状位图像上坏死角B，股骨头的坏死指数公式=(A/180)×(B/180)×100%(图3)。
1.5.4 坏死股骨头标本行Micro-CT检测 使用西门子InvoenMM微型CT对样本进行数据采集与三维重建，以获得矢状面、冠状面和横断面的组织结构；对股骨头坏死区进行构建，确定骨坏死体积[11]。
1.5.5 坏死股骨头血供检测 显微对比剂灌注后采用Micro-CT检测[12]，明确股骨头内主干血管的分布、走行及供血范围，与病理联合分析确定血供改变与病理变化之间的联系。
1.5.6 病理分析并采用容积法测定骨坏死体积 参照
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Lavigne等[13]实验方法将股骨头、颈结合处按时钟刻度进行12等分(图4)，测量股骨头标本坏死角度(ONFH冠状角)，然后据此将股骨头标本切成12等份，用容积法分别测定坏死体积。最后咬除坏死部分的股骨头标本，行常规病理切片，苏木精-伊红染色，组织学观察。 1.6 研究设计
1.6.1 研究设计概要 动物体内实验，诊断性实验。 1.6.2 实验计划 实验计划解决以下关键技术：①骨坏死模型的建立；②MRI值的计算机分析：早期骨坏死MRI可能表现为信号不连续，少数显示为弥散性信号，Mimics自动工具选取较为困难，可通过Photoshop等软件进行轮廓确定，以T1WI序列为主；③应用Micro-CT技术评价股骨头内血供情况，涉及的关键技术包括造影剂的选择，显微灌注操作等，以确保Micro-CT扫描的准确性；④X射线评估在早期骨坏死中准确度差，MRI较为敏感但由于修复区的存在，病变范围往往较真实偏大，离体股骨头标本的Micro-CT及病理分析对骨坏死体积测定较为准确，实验将明确上述方法在不同病灶大小下评估结果的差异。 1.6.3 实验步骤
(1)建立激素性股骨头坏死模型，并根据初次建模情况影像学分析，针对模型状况评估，追加试剂，确保骨坏死模型建立成功；
(2)分不同阶段施行X射线、CT及MRI影像学评价； (3)将相关数据导入计算机进行软件重建分析； (4)对股骨头标本进行解剖，Micro-CT检测； (5)对股骨头标本病理组织学分析；
(6)对获得的数据进行整理完成统计学分析，得出实验结论；
(7)根据研究结论撰写论文，成果鉴定。 1.6.3 技术路线图 见图5。 1.7 指标与观察
1.7.1 主要观察指标 不同方法测定骨坏死体积的比较，主要包括：基于CT及MRI图像计算机重建确定骨坏死体积、坏死股骨头标本行Micro-CT检测确定骨坏死体积、容积法测定股骨头标本的骨坏死体积、基于X射线的Kerboul法评价骨坏死体积。
1.7.2 次要观察指标 显微对比剂灌注后采用Micro-CT检测坏死股骨头血供，与病理联合分析确定血供改变与病理变化之间的联系。
1.7.3 实验观察指标一览表 见表2。
1.8 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件完成数据统计分析，计量资料用x_
±s表示，不同时间点数据比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；计数资料采用χ2检验。P < 0.05认为差异有显著性意义。所得各骨坏死指数、体积值进行相关性分析。统计分析由不参与实验的专业统计人员完成。在所有数据录入、审核完毕后，统计人员应及时完成统计分析工作，交付实验的主要研究者，写出研究报告。
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股骨头坏死ARCO分期系统标准 表1 Table 1 The Association Research Circulation Osseous (ARCO) system
分期 0期 Ⅰ期
标准
骨的组织学检查可见缺血坏死，但其他影像学检查均为阴性
放射线片上无骨坏死的特殊征象，但组织学，MRI或/和骨扫描均有阳性表现 MRI股骨头受累区域<15% MRI股骨头受累区域15%-30% MRI股骨头受累区域> 30%
出现放射线异常，如股骨头斑点状变化，硬化或囊性变形成等，X射线及CT无股骨头塌陷；MRI核素浓集并出现阳性改变；但无股骨头塌陷；髋臼没有变化 MRI股骨头受累区域<15% MRI股骨头受累区域15%-30% MRI股骨头受累区域> 30%
股骨头塌陷，可见新月征但无关节间隙变窄；股骨头或髋臼可以发现小的骨赘 股骨头受累区域<15%；股骨头塌陷<2 mm 股骨头受累区域15%-30%；股骨头塌陷2-4 mm
可见骨性关节炎改变，放射学上关节表面不平，关节间隙变窄；髋臼受累，出现硬化骨、囊性变及骨赘
ⅠA ⅠB
ⅠC
Ⅱ期
ⅡB ⅡC
Ⅲ期 ⅢA
ⅡA
ⅢB
Ⅳ期
ⅢC 股骨头受累区域> 30%；股骨头塌陷> 4 mm
A
图1 Kerboul坏死角度在正、侧位片的评
价方法
Figure 1 Measurement of Kerboul angle revealed on radiology
图注：图中A为示意图；B，C为正、侧位片上的测定方法。
图2
Kim髋磁共振骨坏死评估方法
Measurement of the femoral head by Kim method on Figure 2 MRI
图3 Koo髋磁共振骨坏死评估方法
Figure 3 Measurement of the femoral head by Koo method on MRI
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图4 股骨头12等份 Figure 4 Femoral head equivalented divided into 12 parts
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