爱华网中国组织工程研究 第21卷 第8期 2017–03–18出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 18, 2017 Vol.21, No.8
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植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨缺损
·研究原著·
覃俊君1，尹 东1，裴国献2，江 汕3，陈思圆4，王 簕5，穆天旺6，李明东7 (1广西壮族自治区人民医院骨科，广西壮族自治区南宁市 530021；2解放军第四军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032；3南方医科大学第一临床医学院，广东省广州市 510515；4广东医科大学附属医院骨科，广东省湛江市 524001；5广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150；6深圳市第九医院骨科，广东省深圳市 518116；7海南省人民医院创伤骨科，海南省海口市 570311)
引用本文：覃俊君，尹东，裴国献，江汕，陈思圆，王簕，穆天旺，李明东. 植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨
缺损[J].中国组织工程研究，2017，21(8):1161-1166.
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.003 ORCID: 0000-0001-7522-2829(覃俊君)
文章快速阅读：
文题释义：
降钙素基因相关肽：是广泛分布于神经系统的一种神经肽，其在外周及脊髓参与伤害性信息的传递及痛敏化的形成，并与P物质、兴奋性氨基酸、辣椒素1型受体、趋化因子、激活素、大麻素受体、阿片受体、神经生长因子、血管活性肠肽、5-羟色胺、糖皮质激素等生物活性物质或受体在痛觉调制过程中存在相互影响。
神经肽Y：是一种广泛存在于中枢和外周并维持内环境稳态的激素，它在许多方面调节或参与肾上腺素能神经的作用。
覃俊君，男，1982年生，广西壮族自治区平乐县人，瑶族，2009年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨组织工程研究。
通讯作者: 李明东, 硕士，主治医师，海南省人民医院创伤骨科，海南省海口市 570311
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)08-01161-06 稿件接受：2017-01-06
摘要
背景：神经肽作为存在于神经组织的一种内源性活性物质，作用于全身多个系统，调节体内各系统生理功能。 目的：观察分别植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复兔大段骨缺损对降钙素基因相关肽、神经肽Y表达的影响。
方法：新西兰兔共54只制备股骨大段骨缺损模型，以随机抽签法分为感觉神经束植入组、血管束植入组及对照组，每组各18只，分别给予单纯感觉神经束植入、单纯血管束植入及无血管神经束组织工程骨(对照组)修复治疗，分别于造模后4，8，12周对修复骨段行大体、Masson染色观察，比较修复骨段内降钙素基因相关肽和神经肽Y表达水平。
结果与结论：①造模后4，8，12周，感觉神经束植入、血管束植入组降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平均显著高于对照组(P < 0.05)；②组织工程骨内降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平随时间增加先增高后下降，其中第8周降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平显著高于第4，12周(P < 0.05)；且第4周降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA表达水平显著低于其他时间点(P < 0.05)；③组织工程骨内降钙素基因相关肽主要表达于新生骨骨质边缘、骨膜及血管外周；神经肽Y主要表达于髓腔及血管外周；④结果说明，骨缺损中血管束或感觉神经束植入均可显著上调神经肽降钙素基因相关肽和神经肽Y合成水平，加快骨质修复进程；但感觉神经束植入组织工程骨可能引起支配区感觉功能丧失，故血管束植入更符合正常人体生理功能需求。 关键词：
组织构建；骨组织工程；骨；神经束；血管束；降钙素基因相关肽；神经肽Y；国家自然科学基金 主题词：
降钙素基因相关肽；神经肽Y；组织工程 基金资助：
国家自然科学基金(30600643)
Qin Jun-jun, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, the People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China、
Corresponding Author: Li Ming-dong, Master, Attending physician, Department of Traumatic Orthopedics, Hainan General Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1161
覃俊君，等. 植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨缺损 www.
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Tissue-engineered bone with vascular bundles or sensory nerve tracts for repairing large bone defects
Qin Jun-jun1, Yin Dong1, Pei Guo-xian2, Jiang Shan3, Chen Si-yuan4, Wang Le5, Mu Tian-wang6, Li Ming-dong7
(1Department of Orthopedics, the People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 3Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou
510515, Guangdong Province, China; 4Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China; 5Department of Orthopaedics, the Third Affiliated Hospital of
Guangzhou University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; 6Department of Orthopaedics, the Third
People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518116, Guangdong Province, China; 7Department of Traumatic Orthopedics, Hainan General Hospital, Haikou 570311, Hainan Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Neuropeptides, a kind of endogenous active substance in nerve tissues, can modulate physiological functions of multiple body systems.
OBJECTIVE: To observe the effects of vascular bundles or sensory nerve tracts implanted into tissue-engineered bone for rabbit large bone defects on the expression levels of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and neuropeptide-Y. METHODS: Fifty-four New Zealand rabbits were enrolled to make model of large bone defects, and then, the animal models were randomly divided into three groups, including sensory nerve tract, vascular bundle, and control groups (n=18 per group), followed by implanted with sensory nerve tracts, vascular bundle, and tissue-engineered bone without sensory tracts or vascular bundle, respectively. The defected bone received gross and Masson staining at 4, 8 and 12 weeks after modeling, to compare the expression levels of CGRP and neuropeptide-Y in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: mRNA expression levels of CGRP and neuropeptide-Y in the sensory nerve tract and vascular bundle groups were significantly higher than those in the control group at different time points after modeling (P < 0.05). mRNA expression levels of CGRP and neuropeptide-Y in the tissue-engineered bone began to be increased and peaked at the 8th week, and then decreased (P < 0.05), which were the lowest at the 4th week (P < 0.05).
Immunohistochemical staining results showed that CGRP was mainly found in the bridge, periosteum of newly born bones and around blood vessels; while neuropeptide-Y mainly localized in the medullary cavity and around blood vessels. These results indicate that the implantation of vascular bundle and sensory nerve tracts for bone defects can upregulate the expression levels of CGRP and neuropeptide-Y, and promote bone repair. However, sensory tract implantation may cause sensory impairment; thereafter, vascular bundle implantation is more suitable for ideal tissue-engineered construction to meet physical requirements.
Subject headings: Calcitonin Gene-Related Peptide; Neuropeptide Y; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30600643
Cite this article: Qin JJ, Yin D, Pei GX, Jiang S, Chen SY, Wang L, Mu TW, Li MD. Tissue-engineered bone with vascular bundles or sensory nerve tracts for repairing large bone defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(8):1161-1166.
0 引言 Introduction
降钙素基因相关肽属于感觉神经肽，骨组织、神经组织、肌肉组织等全身各组织内均可找到其阳性神经纤维分布[1-2]。神经肽Y属于自主神经肽，神经肽Y的神经纤维主要作用于较大的血管。体内降钙素基因相关肽与受体结合，参与调控成骨细胞和破骨细胞功能，从而参与调节骨组织的新陈代谢。构建带有血管营养或神经支配的复合组织工程骨符合人体生理要求，可能是修复大段骨缺损的较理想方案。为研究神经束植入与血管束植入对神经肽分泌的影响，作者通过将血管束与感觉神经束分别单独置入复合组织工程骨用于骨缺损模型修复，并对术后降钙素基因相关肽和神经肽Y表达位置和水平进行比较，探讨血管、神经再生与骨质再生间相关性，并为临床建立理想复合组织工程骨提供依据。
医科大学骨组织工程实验室完成。
1.3 材料 5月龄健康新西兰兔54只，体质量2.0-3.0 kg，雌雄不限，均购自南方医院实验动物中心。多孔且带侧槽的β-磷酸三钙(β-TCP)规格为ф8 mm×15 mm，购自上海贝奥路公司，SuperScrip Ⅲ First-strand、Trizol、PlatinumTaq购自美国Invitrogen公司，降钙素基因相关肽、神经肽Y引物均购自上海英骏公司，dNTPS购自日本TAKARA公司，所用一抗包括兔多克隆抗体降钙素基因相关肽和兔多克隆抗体神经肽Y均购自武汉博士德公司，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。荧光定量仪器型号：BIO-rad IQ5。
1.4 实验方法 选择新西兰兔共54只，以随机抽签法分为感觉神经束植入组、血管束植入组及对照组，每组各18只，分别给予单纯感觉神经束植入、单纯血管束植入及无血管神经束组织工程骨修复治疗。
1.4.1 组织工程骨的体外制备与实验分组 大鼠采用肌肉注射麻醉，麻醉液为氯胺酮+速眠新+阿托品；在大鼠髂骨抽取红骨髓3.0-4.0 mL(含骨髓间充质干细胞)，经原代、
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1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2007年6月至2009年6月在南方
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覃俊君，等. 植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨缺损 传代培养后诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，待细胞浓度达109 L-1后将其负压吸入预开槽β-磷酸三钙内，体外培养7 d。
1.4.2 组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损模型的制备 于新西兰大白兔左侧后肢大腿前外侧纵形切开，切口长度7.0-8.0 cm；并锐性分开股直肌和股内侧肌间隙，充分暴露股骨组织；采用常规钢板放置于股骨前外侧，钢板植入前预弯6°-8°，以保证钢板和股骨外凸弧度相符；与钢板两侧远端钻孔、攻丝，并拧入螺钉4枚，且同侧2个螺钉间以钢丝环扎固定；沿钢板中间两孔外侧缘对骨膜进行部分剥离，再锯断股骨形成1.5 cm骨缺损，并将体外构建完成组织工程骨置入骨缺损处；进而于同侧股骨内侧中央纵形切开，于股三角内显露、分离大隐神经及股血管束；大隐神经游离至合适长度后作锐性切断，置入组织工程骨预开槽内，设为感觉神经束植入组；大隐神经股血管束游离至合适长度后顺行置入组织工程骨预开槽内，并以线固定，无需锐性切断，设为血管束植入组；大隐神经和股血管束游离，但未置入组织工程骨预开槽内，设为对照组；全部模型兔完成手术后以0.9%氯化钠溶液对切口进行冲洗，逐层缝合并包扎结束手术。
1.4.3 大体标本观察、Masson染色及免疫组织化学染色于造模后第4，8，12周每组分别处死各6只模型兔，取出左侧股骨后对组织工程骨表面改变、骨痂形成及缺损修复情况进行观察；从中切取组织工程骨段，常规多聚甲醛固定和乙二胺四乙酸脱钙后进行石蜡包埋，连续石蜡切片厚度5 μm，标记顺序后进行Masson染色和免疫组织化学染色；其中Masson染色主要用于骨质和血管生成情况；免疫组织化学染色指标包括降钙素基因相关肽和神经肽Y，染色玻片上包括待测切片、降钙素基因相关肽和神经肽Y阳性表达切片，阴性对照采用PBS代替一抗；随机选取4张相同顺序标记组织切片进行免疫组织化学染色，光镜下进行表达强度判断。
1.4.4 Real-time PCR检测 选择人、大鼠及小鼠神经肽Y序列高度保守且同源片段进行降钙素基因相关肽和神经肽Y引物设计，上海Invitrogen公司负责引物设计合成；于术后第4，8，12周每组分别处死模型动物，于组织工程骨两端与正常骨交界处、组织工程骨中点共3个位置各钳取骨组织40 mg；全部骨组织中加入Trizol 1 mL研磨吹打，室温放置5 min后进行总RNA提取；取5 μg 总RNA 用Promega 公司的反转录试剂盒反转录cDNA。实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction ，RT-PCR)在荧光定量仪器完成(型号：BIO-rad IQ5)，反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸45 s，40个循环。采用2-
??Ct法计算目的
基因表达量计算[3]。引物序列见表1。
1.5 主要观察指标 复合组织工程骨大体标本观察、组织学观察、降钙素基因相关肽、神经肽Y免疫组织化学及实
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时荧光定量PCR等。
表
1 扩增降钙素基因相关肽、神经肽Y基因及β-actin基因mRNA的引物
Table 1 neuropeptide-
mRNA primers of calcitonin gene-related peptide, Y and β-actin 基因
引物 引物序列(5’→ 3’) 扩增长度(bp) 降钙素基因相关肽 forward 5’-AGC AGG AAG ACC 158
AGG AGC AG-3’
reverse
5’-CAC ATT GGT GGG
CAC AAA GT-3’
神经肽
Y forward 5’-GAA GGG TCT TCA 129 AGC CTG GT-3’
reverse 5’-GCG ACA CTA CAT CAA TCT CAT CA-3’ β -actin
forward
5’-CCG TCT TCC CCT 137 CCA TCG T-3’
reverse
5’-TTC GTG CTC GAT
GGG GTA CT-3’
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析；统计学方法采用析因设计方差分析、单向方差分析及LSD-t 检验。P < 0.05判定为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰兔54只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 大体标本观察 术后4周模型兔均可见骨痂少量形成，缺损周围出现纤维结缔组织；造模后8周时模型兔骨痂形成量多于造模后4周和12周，其中感觉神经束植入、血管束植入组骨缺损区域被骨痂完全包裹，对照组骨缺损区域未被骨痂完全包裹；造模后12周时骨痂基本成熟，出现皮质骨结构，且感觉神经束植入、血管束植入组形成皮质骨结构范围多于对照组(图1)。 2.3 组织学观察结果
2.3.1 苏木精-伊红染色 造模后4周模型兔血管束周围和置入材料表面可见血管内皮细胞出现与骨痂中，且新生骨取代部分置入材料；造模后8周模型兔血管内皮细胞增多出现管腔状结构，且新生骨增多出现板层状结构；造模后12周模型兔可见多量血管状结构出现，新生骨取代大部分置入材料，并出现髓腔。
2.3.2 Masson三色染色 造模后4周模型兔可见植入材料中新生血管、成骨细胞及胶原纤维大量出现；造模后8周时，植入材料中胶原纤维量下降，骨组织大量形成；造模后12周可见胶原纤维矿化并出现板层骨结构。 2.3.3 降钙素基因相关肽免疫组织化学染色 造模后4周模型兔中，感觉神经束植入、血管束植入组降钙素基因相关肽主要表达在血管和骨髓处，部分出现在新生骨边缘和骨膜处，对照组则可见新生骨边缘少量表达。
3组随着观察时间延长降钙素基因相关肽表达量增加(图2)。
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8周 12周
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感觉神经束植入组
血管束植入组 对照组
4周 8周 12周
图1 兔造模后8，12周各组大体标本观察 Figure 1 Gross
observation of the rabbit bone in each group at 8 and 12 weeks after modeling 图注：造模后8周，感觉神经束植入组(A)、血管束植入组(C)骨痂较多，未成熟，完全包裹组织工程骨，对照组(E)骨痂部分包裹组织工程骨；造模后12周，各组骨痂较成熟，形成大量皮质骨结构，感觉神经束植入组(B)、血管束植入组(D)新生骨完全包裹组织工程骨，对照组(F)部分包裹组织工程骨。
图2 兔造模后4，8，12周各组降钙素基因相关肽免疫组织化学染色(×400) Figure 2
Immunohistochemical staining of calcitonin gene-related peptide in each group at 4, 8 and 12 weeks after modeling (×400) 图注：4周时可在新生胶原纤维组织边缘见降钙素基因相关肽的阳性表达；8，12周新生骨质边缘和血管周围见大量降钙素基因相关肽阳性表达，骨髓周围也可见降钙素基因相关肽阳性表达；各时间点感觉神经束植入组、血管束植入组降钙素基因相关肽阳性表达(++)强于对照组(+)。
感觉神经束植入组
血管束植入组 对照组
A B
C
图3 兔造模后12周各组神经肽Y免疫组织化学染色(×400)
Figure 3 Immunohistochemical staining of neuropeptide-Y in each group at 12 weeks after modeling (×400) 图注：12周时神经肽Y的阳性表达多在骨髓和血管周围(红色箭头所示为阳性表达)；感觉神经束植入组(A)、血管束植入组(B)神经肽Y阳性表达强于对照组(C)。
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降钙素基因相关肽mRNA/beta-actin mRNA
感觉神经束植入组 血管束植入组
神经肽mRNA/beta-actinmRNA
4周 8周 12周
4周 8周 12周
不同时间各组间降钙素基因相关肽和神经肽Y mRNA的表达量比较 图4
Figure 4 Comparison of the mRNA expression levels of calcitonin gene-related peptide and neuropeptide-Y among groups at different time points
图注：感觉神经植入组、血管束植入组与对照组相比(P < 0.05)，血管束植入组与感觉神经植入组相比(P < 0.05)
2.3.4 神经肽Y免疫组织化学 造模后4周模型兔均可见神经肽Y表达，主要位于灶状骨髓血管周围；3组随着观察时间延长神经肽Y灶状骨髓血管周围表达量增加(图3)。 2.4 Real-time PCR 3组随着观察时间延长神经肽Y mRNA表达水平于造模后8周达到峰值，均显著高于造模后4，12周；其中造模后4周神经肽Y mRNA表达水平显著低于其他时间点，差异有显著性意义(P < 0.001)；而在同一时间点3组之间差异也有显著性意义(均为P < 0.001)；造模后各时间点感觉神经束植入组、血管束植入组神经肽Y mRNA表达水平均显著高于对照组(P < 0.05)；同时血管束植入组神经肽Y mRNA表达水平均显著高于感觉神经束植入组(P < 0.05) (图4) 。
入血管束周围存在自主神经支配；模型兔股骨缺损处单纯置入血管束后可以出芽方式在周围组织中形成新血管，而附着周围自主神经纤维亦可形成相同分支，并在缺损处分泌神经肽，调节缺损出成骨作用。研究结果中，模型兔降钙素基因相关肽和神经肽Y表达主要位于新生骨质边缘、骨膜及血管周围，且在单纯血管束置入组织工程骨中表达最多，进一步说明血管再生可提高骨组织神经肽表达水平。
本次研究结果显示，降钙素基因相关肽表达主要分布血管和骨膜的周围，且随观察时间延长，新生血管量越多，则降钙素基因相关肽表达量亦随之增加，这说明感觉神经生长与新生血管形成具有相关性，新生血管可为感觉神经形成提供必要营养物质，两者相互作用起到协同成骨促进作用。Masaki等[11]研究显示血管可为分离神经提供充足营养以实现良好再生。而国内外学者研究显示，制备神经干缺损模型，诱使相应骨骼肌丧失神经支配而变性，而通过植入单纯血管并以此为桥接体进行神经干缺损修复，神经再生效果显著优于无血供骨骼肌[12-14]，这一结果进一步说明血管可改善神经新陈代谢，促进神经再生生修复。
已有研究显示，血管束置入组织工程骨可为骨痂形成提供良好条件，且神经肽表达水平随骨痂形成、骨改建进程变化而改变[15-16]。而降钙素基因相关肽主要表达在大鼠胫骨骨折部位骨膜、纤维肉芽组织及新生骨组织中；且骨痂部位形成感觉神经纤维能可于局部释放高于血清含量降钙素基因相关肽，加速骨痂形成和改建进程[17-18]。同时另一组研究采用ELISA法对骨折后24 h内患者血浆降钙素基因相关肽水平进行检测，发现其表达量较入院时明显增加，间接提示降钙素基因相关肽可能参与骨折组织修复进程[19-21]。研究结果中，随着观察时间延长，模型大鼠组织工程骨周围新生骨组织内降钙素基因相关肽和神经肽Y表达水平均先增高后降低，其中第8周表达水平最高，而第4周表达水平则最低，这与骨痂形成和骨改造塑形过程骨痂先增多后减少趋势相一致。同时血管束植入组神经肽表达显著高于感觉神经束
植入组、对照组，则证实神经肽分泌与血管束植入具有相
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3 讨论 Discussion
近年来研究显示，含有交感神经成分、感觉神经成分的肽能神经于骨痂中被检测到[4-7]；在骨折生长、成熟、改造及塑形过程中，新生骨痂中肽能神经长入可通过分泌神经肽对骨折愈合进程进行调节[8-9]。故建立存在神经支配组织工程骨在提高神经肽表达水平，促进局部成骨方面优势明显。部分学者认为，组织工程骨内依次植入感觉神经、运动神经用于模型兔股骨缺损修复，可见复合运动神经束植入与单纯组织工程骨在局部成骨方面效果相似； 复合感觉神经束植入组织工程骨能够有效提高组织工程骨中成骨细胞分化水平，加快缺损处成骨进程；而复合运动神经束植入并无次效果，作者认为这可能与神经肽主要作用于成骨细胞、破骨细胞或骨膜靶细胞受体，通过对信号传导通路进行调节而改善骨细胞代谢有关[10]；此研究为组织工程骨中重建神经束置入方案提供理论基础重。但在临床实际应用过程中，组织工程骨神经化存在一定问题，即需要使患者丧失部分感觉功能，且对术者技术操作水平较高。
本次研究结果显示，植入血管束与植入感觉神经束组织工程骨模型兔比较，造模后12周内植入血管束模型兔体内神经肽表达水平更高，这可能与以下因素密切相关：植
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覃俊君，等. 植入单纯血管束、感觉神经束的组织工程骨修复大段骨缺损 关性。
提高组织工程骨内血液供应水平和增加神经支配已被证实是影响组织工程化骨组织体内存活关键因素之一；故构建带含有血管神经支配组织工程骨对于骨组织工程从基础研究向临床转化具有重要意义。实验证明骨缺损中血管束或感觉神经束植入均可显著上调神经肽降钙素基因相关肽和神经肽Y合成水平，加快骨质修复进程；但感觉神经束植入组织工程骨可能引起支配区感觉功能丧失，故血管束植入更符合正常人体生理机能需求。
作者贡献：实验设计为裴国献和江汕，实验实施为覃俊君和陈思圆，实验评估为李明东，覃俊君收集资料和成文，李明东和尹东审校。
利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。
伦理问题：实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在戊巴比妥钠麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
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