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免疫组化染色
一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：
1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。
（1）二甲苯、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟 95%，2分钟 80%，2分钟 70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制
（1）储备液的配制：
A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml B液：枸橼酸 21g + 蒸馏水1000ml
（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml
抗原修复的方法：
（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖
上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高
压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸
钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的
枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟（最佳温度为.9295℃）
（3）酶消化处理：此略。
抗原修复的注意事项：
（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织 周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)
按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50l+5l (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2小
时
（也可置于4℃冰箱过夜）。
8．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。
10．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
11．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40分钟。
12．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：DAB的配制
（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全
溶解后分装成 1ml,100l,50l，20l等，—20℃，冻存。
（2）工作液：DAB 储备液20l + PBS 1000l + 3% H2O2 5l
14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15分钟。
17．梯度酒精脱水：
80%，2分钟 95%，2分钟 100%，2次，5分钟。
18．二甲苯透明：
I，II（二甲苯）各5分钟
19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
二．细胞爬片的免疫组化染色：
1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定2030分钟。
2. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
3. 打孔液浸泡5分钟。
4. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
5. 后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。
注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。
三．冰冻切片的免疫组化染色：
1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6m。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)
6. 3% H2o2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;
7. 用PBS 洗2次,每次5分钟;
8. 接前面实验步骤第六步.
四．切片的预处理：
1. 洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。
2. 洗液（含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。
3. APES（1:50 丙酮溶液） 10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。
4. 纯丙酮I，约10秒。纯丙酮II，约5秒
晾干或烤箱内烤干，备用。
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