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【摘要】 目的：建立一种简便、快速、准确、可靠的顶空气相色谱法对血中乙醇进行定性、定量分析。方法：采用顶空进样器，利用气体对挥发性物质的萃取原理进行样品前处理，叔丁醇为内标物，气相色谱仪进行分离分析，用保留时间定性，内标标准曲线法定量。结果：该方法线性范围为0.2～2.0 mg/ml，方法回收率为100.21%，最低检测限（the lowest limit of detection，LLOD）为0.01 mg/ml。结论：该方法可用于法医毒物分析血中乙醇的检测及实验室能力认可中能力验证计划样品的测定，结果令人满意。
【关键词】 法医毒物分； 顶空气相色谱法； 血液； 乙醇
中图分类号 R595.6 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2016）22-0052-02
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.22.026
我国交通法规定，驾驶员血液中乙醇浓度大于或者等于0.2 mg/ml，小于0.8 mg/ml的驾驶行为为酒后驾车，乙醇浓度大于或者等于0.8 mg/ml的驾驶行为为醉酒驾车[1-2]。“酒驾”、“醉驾”是当前道路交通事故的主要肇事原因之一。本文在参考大量文献的基础上[3]，对双柱双检测器顶空气相色谱法进行了探索，并取得了满意的结果，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
俊齐GC2002气相色谱仪；顶空自动进样器（HS-16A）；乙醇标准溶液（2.0 mg/ml，购自司法部司法鉴定科学技术研究所）；叔丁醇（色谱纯）。待测样品：CNAS Z0039样品1；CNAS Z0039样品2。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制 乙醇标准储备液：用2.0 mg/ml逐级稀释为浓度1.6、1.2、1.0、0.8、0.4、0.2 mg/ml的乙醇标准储备液系列。内标叔丁醇溶液：在十万分之一电子天平上准确称取一定量的叔丁醇（色谱纯）放入100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，使其浓度为4 mg/ml，作为叔丁醇储备液；准确移取一定量上述叔丁醇储备液放入250 ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，使其浓度为40 μg/ml，得内标叔丁醇标准溶液。
1.2.2 顶空气相色谱条件 俊齐GC2002顶空气相色谱仪：001通道色谱柱，DB-ALC2（30 m×0.32 mm×1.2 μm），002通道色谱柱；DB-ALC1（30 m×0.32 mm×1.8 μm）；柱温40 ℃恒温；载气N2流速8 ml/min；进样口温度150 ℃，检测器温度250 ℃，加热箱温度65 ℃，定量环温度105 ℃，传输线温度110 ℃；气相循环时间3.5 min，样品瓶加热平衡时间10.0 min，样品瓶加压时间0.10 min，定量环充满时间0.10 min，定量环平衡时间0.05 min，进样时间1.00 min。
1.2.3 定性分析 取空白全血两份，一份为0.2 ml于20 ml顶空瓶内，加入1.0 ml内标叔丁醇，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后，为空白对照样品；另一份为0.196 ml于20 ml顶空瓶内，加入0.04 ml乙醇标准溶液（2.0 mg/ml）及1.0 ml内标叔丁醇，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后，为乙醇标准对照样品；在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析。空白样品作为阴性对照；乙醇标准对照样品作为阳性对照；为待测样品中乙醇定性分析的依据。精确移取待测样品全血0.2 ml各4份于20 ml顶空瓶内，加1.0 ml内标叔丁醇，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后，样品为：CNAS Z0039样品1-1、CNAS Z0039样品1-2、CNAS Z0039样品1-3、CNAS Z0039样品1-4、CNAS Z0039样品2-1、CNAS Z0039样品2-2、CNAS Z0039样品2-3、CNAS Z0039样品2-4，在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析。
1.2.4 定量分析 把1.2.3所得CNAS Z0039样品1-1、CNAS Z0039样品1-2、CNAS Z0039样品1-3、CNAS Z0039样品1-4、CNAS Z0039样品2-1、CNAS Z0039样品2-2、CNAS Z0039样品2-3、CNAS Z0039样品2-4，在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析。分别精确移取0.2 ml乙醇标准储备液（2.0、1.6、1.2、1.0、0.8、0.4、0.2 mg/ml，每个浓度点平行配制两个样品）于20 ml顶空瓶内，分别加入1.0 ml内标叔丁醇，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后，配制成乙醇标准工作液系列，把乙醇标准工作液系列在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析。以乙醇浓度为横坐标，乙醇峰面积平均值除以内标峰面积平均值为纵坐标绘制工作曲线，进行线性回归，用回归方程对待测样品中乙醇进行定量分析。
2 结果
2.1 定性结果
空白对照样品仅在tR=2.250 min出现内标叔丁醇峰；乙醇标准对照样品则分别在tR=1.678 min、tR=2.243 min出现乙醇峰、内标叔丁醇峰；空白对照样品与乙醇标准对照样进行比对，内标叔丁醇峰保留时间存在一定的误差（误差为0.31%），这可能是由于电压不稳定及仪器产生波动引起的，但误差不超过3%，都不会影响定性准确性；CNAS Z0039样品1-1、CNAS Z0039样品1-2、CNAS Z0039样品1-3、CNAS Z0039样品1-4、CNAS Z0039样品2-1、CNAS Z0039样品2-2、CNAS Z0039样品2-3、CNAS Z0039样品2-4分别在1.638、1.643、1.678、1.677、1.674、1.669、1.651、1.643 min出现乙醇的色谱峰（与乙醇标准对照品中乙醇的保留时间比较，误差为2.41%），在2.203、2.207、2.243、2.243、2.237、2.233、2.214、2.205 min出现叔丁醇内标物的色谱峰（与乙醇标准对照品中叔丁醇内标物的保留时间比较，误差为1.80%）。样品与乙醇标准对照样保留时间比对存在微小的差别，误差小于3%，不影响定性的准确性，可以得出样品中定性检出乙醇的结论。 2.2 方法回收率
用移液器精确吸取空白全血0.50 ml一份，加入2.0 mg/ml乙醇标准溶液0.50 ml，充分混匀。再用移液器准确平行吸取上述空白血添加样4份，体积均为0.20 ml于20 ml顶空瓶内，分别加入1.00 ml叔丁醇内标标准溶液，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后，制得空白血添加样品-1、空白血添加样品-2、空白血添加样品-3、空白血添加样品-4备用。在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析。用1.2.4的线性回归方程计算，测得乙醇值，测得值除以添加值再乘以100%得出回收率；其中回收率为100.21%。
2.3 方法稳定性
考察方法的稳定性，把按2.2方法配制的空白血添加样品，分别在样品处理前、后室温放置1、3、6、12、24 h后，在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，进行气相色谱分析，分析结果相对误差均小于8%。结果显示，所建方法用于全血中乙醇的检测稳定性好。
2.4 最低检测限
分别准确吸取一定量0.2 mg/ml乙醇标准储备液，用蒸馏水梯度稀释配制成乙醇含量为0.02、0.01、0.005 mg/ml的乙醇标准储备液。分别准确吸取以上浓度的乙醇标准储备液0.20 ml于20 ml顶空瓶内，加入1.00 ml内标叔丁醇标准溶液，盖上橡胶垫及铝封，用顶空钳密封，充分混匀后（配制得乙醇标准工作液），在1.2.2色谱条件下，用顶空进样器进样，分别对上述三个乙醇标准工作液进行气相色谱分析。从色谱图可知，乙醇含量为0.02、0.01 mg/ml的标准工作液S/N>3，乙醇含量为0.005 mg/ml的标准工作液S/N 3 讨论
采用双柱双检测器顶空气相色谱法对血中乙醇进行测定具有许多优点。首先，顶空气相色谱法利用气体对挥发性物质的萃取原理进行样品前处理，消除了基质对对检测的干扰及对仪器的污染，简化了样品前处理过程及对仪器的维护[4-6]。其次，双柱双检测器，虽然仅进样一次，但是采用了性质不同的两根色谱柱对样品进行分离分析，不再需要用其他方法进行确证，保证了方法的准确、可靠性。最后，需要特别提醒的是顶空气相色谱法在操作过程中要确保顶空平衡温度及顶空平衡时间的一致性，这直接关系到定性定量的准确性。
参考文献
[1]段爱军，常文海，何全利，等.血液乙醇检测的影响因素分析[J].医药论坛杂志，2005，26（6）：6.
[2]卓先义，卜俊，向平，等.血液中乙醇检测结果的法医学分析[J].中国司法鉴定，2010，1（48）：22-25.
[3]王冬梅，傅冬梅，贺柳杨.血清、全血中乙醇测定结果的比较分析[J].国际检验医学杂志，2014，35（5）：636-637.
[4]陶林静.血液标本临床检验不合格的原因与对策研究[J].中国医学创新，2015，12（2）：111-114.
[5]赵东玲，王粉安，郑海波，等.顶空气相色谱法快速测定全血中乙醇与甲醇的含量[J].中国药业，2013，22（20）：53-54.
[6]王振华，曾令清，曲圆圆，等.顶空气相色谱内标法测定唾液中乙醇含量[J].江西中医学院学报，2011，23（5）：71-73.
