爱华网实验一PCR基因扩增
一、实验目的与要求
（1）掌握PCR反应的基本原理；
（2）了解PCR的基本操作流程。
二、实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。
1. 缓冲液：
10～50 mMTris- HCl (pH8.4)：维持Taq酶作用环境的偏碱性。
25～50 mMKCl：促进引物退火，>50 mM会抑制Taq酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
2. dNTPs :
dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物，dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系。
0.02～0.2 mM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。
dNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs浓度之间的关系， Mg2+浓度比 dNTPs 浓度高0.2～2.5 mM。
过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。
过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。
保存：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。
3. MgCl2：1.5～2.0 mM
Taq酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，在一
般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜
过量：增加非特异扩增并影响产率，
过低：则酶活性显著下降。
4. 引物 (Primer-P)：0.2～1μM
预扩增核酸片段两端的已知序列，是PCR特异性反应的关键
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。
5. Taq DNA聚合酶：耐高热
0.5～5 U / 100 μl
特点：以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将４种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按引物5‘-3’的方向，合成新的DNA链；无Klenow酶所具有的3‘-5’外切酶活性，故无校正功能，错误频率为0.25％，即在25轮循环后，其扩增产物的顺序中400个碱基可能出现一个篡改（错误掺入）碱基。 偏高：引物非特异产物的扩增
偏低：产物量降低
6. 模板DNA (Template):
最低102～105bp DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μl
过高：非特异产物增加
过低：产量降低
传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀
蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
7. 水：去离子水，补足整个反应体积。
按顺序将各成分加入一无菌PCR专用离心管，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
三、仪器及试剂
1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等
2.试剂：
1）10×PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：
750 mmol/LTris-HCl、200 mmol/L (NH4)2SO4、0.1%Tween-20
2）模板DNA
3）dNTP 混合液
4）Taq聚合酶
5）上游和下游寡核苷酸引物
四、操作步骤
1、用无菌去离子水将模板稀释至20ng/μl，-20℃保存备用；
2、PCR 反应体系（如20μl）如下:
10×PCR 缓冲液
25mmol/L MgCl22×mix 10μl
2.5mmol/L dNTP
Taq DNA polymerase
primer（上游） 0.5μl
primer（下游）
DNA (20ng/μl) 0.5μl
H2O 9μl
共计 20μl
不足20μl的体积用无菌去离子水补足。每次反应均以无菌去离子水替代模板DNA 作为对照。视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
3、将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。
4、PCR反应热循环程序设置：
1）预变性：94℃3min
2）变性：94℃30s
3）退火：55℃30s
4）延伸：72℃30s
5）补平：72℃5min
重复步骤2～4共30个循环
5、反应结束后短暂离心，扩增产物少量用2%琼脂糖凝胶在1×TBE电泳缓冲液中电泳，以凝胶成像系统检测并记录扩增产物在琼脂糖凝胶上的图谱，其余置4℃保存备用。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的与要求
（1）了解琼脂糖凝胶电泳的原理；
（2）掌握琼脂糖凝胶的制备及电泳检测DNA的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。
三、仪器及试剂
1.仪器及耗材：
水平电泳槽、电泳仪（附加装置如恒温循环冷却装置）、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、点样板、100 mL锥形瓶、量筒、吸头等。
2.试剂及配制：
TBE缓冲液：45mM/L Tris-硼酸 1mM/L EDTA（TAE为醋酸）
溴化乙啶贮存液：10 mg/mL溴化乙啶
10×凝胶加样缓冲液：0.4%溴酚蓝，60%蔗糖
DNA样品
DNA Ladder
琼脂糖
四、操作步骤
1. 制备2％琼脂糖凝胶（大胶用40mL，小胶用20mL）：称取0.8 g（0.4 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入40 mL（20mL）1×TBE，瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。待胶液冷至60℃左右时，加入溴化乙锭溶液（或其替代物）1μL，轻轻混匀。
2. 胶板制备：装好置胶槽，将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入
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