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贝类毒素研究进展

——麻痹性贝毒的研究

摘要：

食源性疾病是当今国际上最为突出的公共卫生问题之一，而在全世界多种海洋浮游藻中，大约有260多种能形成赤潮，其中有7O多种能产生毒素。由于许多有毒的藻类,被鱼、虾、贝类等海洋生物摄食,其毒素在这些生物体内蓄积,这类毒素称为贝毒,人们食用染毒的贝类可发生中毒,重则死亡。早在90年代，大亚湾水域赤潮发生频繁，在对广东近海岸海域进行监测研究中已发现有裸甲藻等引起贝毒的主要因素，及近几年的连云港地区发生半褶织纹螺中毒事件，贝类毒素问题是目前海产品食用安全的重中之中，贝类毒素的研究也成为了该领域重点研究对象。

关键词：贝类毒素 污染贝类 生物测定法 麻痹性贝毒

1麻痹性贝毒

1.1麻痹性贝毒概况

麻痹性贝毒( paralytic shellfish poisoning,PSP)是一类阻断神经细胞钠离子通道,对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素。海洋中的麻痹性贝类毒素主要由有毒的甲藻产生,在全球近岸海域分布广泛,许多食用贝类对其有很强的累积能力,该毒素对人体毒性极强,当人们误食染毒的贝类时就可能发生中毒,因而对人类健康影响很大。在我国近海可食用贝类中含有麻痹性贝毒,福建省东山县、广东省大亚湾及台湾省近年都发生因食用染毒贝类而引起多人中毒或死亡事件。鉴于贝毒对人类健康的危害,我国有关部门已经制定了相应的贝毒素卫生质量标准和发生有毒赤潮事件后的应对措施,通过政府行政手段尽量减少食用贝类的中毒事件发生。

在实际生活中，PSP 中毒比较常见。在食用含PSP 的海产品后约5～30分钟 内就会出现唇、牙床及舌周麻木并伴有手指、脚趾麻木，6小时后可能扩散到双臂、双脚和颈部。吸收量大时， 在12小时内就会由于呼吸器官麻痹而引起窒息死亡。PSP 是一类剧毒的含氮杂环有机化合物，其毒性大小因所含化合物组分的不同差异较大。

但是,由于多种原因,我国尚未建立完整的PSP监测体系。科研工作者已对我国局部海域中贝类PSP进行了调查,毒素的检测主要为小白鼠生物法,缺乏对贝类毒素进行定性及成分分析。为了进一步研究我国沿海麻痹性贝毒现状,学者在小白鼠生物检测后对测定结果为阳性的贝类样品进行高效液相色谱(HPLC)分析,通过对来自不同海区贝类的毒素定性和定量分析,比较不同海区贝毒素成分特征差异,为弄清我国沿海的PSP分布,制定适宜的贝毒素监测方案提供参考。

1.2 我国PSP的产毒藻类及其毒素成分

我国PSP的产毒藻类及其毒素成分PSP毒素主要产自海洋的甲藻类,有毒甲藻可能是PSP的最初来源。我国海域常见的PSP产毒藻类有4种: A. tam arense、A. catenella、A. m inutum 和G. catenatum

1.3 污染贝类及毒素成分

滤食贝类对产毒藻类的毒性不敏感,通过摄食蓄积藻类毒素成为沾污贝毒的有毒

贝类。由于同一地点的产毒藻类具有一定的优势种,造成同一地点不同种的贝类体内的毒素成分基本相同

211 麻痹性贝毒污染状况

在所检测的贝类样品中,海湾扇贝和华贵栉孔扇贝PSP

的检测结果为阳性,其它5 种贝类的检测结果均为阴性(见表

1) ,其中海湾扇贝与华贵栉孔扇贝PSP 毒力按照消化腺与可

食性部分的加权平均毒力计算。在84 个样品中,染毒样品有

21 个,染毒率为25 %。海湾扇贝样品有9 个月检出有PSP ,华

贵栉孔扇贝12 个月中均检出PSP ,并且检测出的PSP 均存在

于海湾扇贝和华贵栉孔扇贝消化腺中,其肌肉和其它软组织

以及其它5 种贝类中未检出。PSP 毒性大小随季节变化而变

化,呈现出一定的规律性:海湾扇贝春季毒力较高,秋季未检

测出染毒,毒力大小分布在0121～0168MUPg 肉之间;华贵栉

孔扇贝冬季毒力较高,夏季毒力较低,毒力大小分布在0118～

1145MUPg 肉之间。根据FAO 及我国渔政渔港监督管理局制

定的贝类PSP 安全食用警戒线(4MUPg 肉) ,所有样品均在安

全食用范围内。但海湾扇贝消化腺中,2004 年4、5、6 月的PSP

含量超标(4MUPg) (见表2) 。其中4 月PSP 含量高达4191

MUPg 腺;华贵栉孔扇贝的消化腺中,2004 年11～12 月和2005

年1～3 日这5 个月的PSP 含量超标,其中2004 年12 月PSP

含量高达11148MUPg ,远远超出了4MUPg 的安全食用范围。

2 贝类毒素的检测

2.1贝毒的质量标准

国家质量监督检验检疫总局在2001年发布的GB 18421-2001《海洋生物质量》标准，规定麻痹性贝毒素(PsP)含量≤O．8mg／kg。国家质量监督检验检疫总局在2001年发布的GB 18406．4—2001《农产品安全质量无公害水产品的安全要求》标准，规定麻痹性贝毒素(PSP)含量不得超过8O微克／100克，腹泻性贝毒素(DSP)含量不得超过8O微克／l00克。

2.2 麻痹性贝毒的常规检测方法

2.2.1小鼠生物法(Mouse bioassay, MBA)

MBA方法是1937年由Sommer and Mayer建立的,是目前唯一得到国际公认的AOAC标准生物检测PSP的方法。MBA方法相对简单,能测定所抽提的全部毒素的毒性,是目前所有实验室认可的标准检测方法。现阶段我国在进出口海产品贝毒检测及调查分析沿海PSP的污染状况时广泛使用。但MBA方法不能测定毒素的组分和结构,而且容易出现假阳性结果。

在广州市疾病预防控制中心毒理学检验科拟采用标准近交系小鼠C57BL建立PSP 检测方法，旨为贝类食品安全检测提供可使用的实验动物品系资料。小鼠单位法所采用的ddy系小鼠在我国不易获得，因此我们采用了对外源性化学毒物比较敏感的C57BL小鼠建立PSP 检测方法。研究结果表明，C57BL小鼠单位法检测结果与酶联免疫吸附试剂盒法检测结果相关性较好，关联系数r为＋0．86，提示酶

联免疫吸附试剂盒法检测结果阳性时，C57BL小鼠单位法检测结果也趋向于阳性，表明C57BL小鼠单位法可用于麻痹性贝类毒素的检测。

2.2.2高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatog2raphy, HPLC)

HPLC分析检测PSP方法是由日本人Oshima发展建立的,具有灵敏、准确、可靠、能确定各种毒素成分、使用广泛、所需检测的样品量少等优点,已被国际上广泛接受为标准方法。利用PSP毒素在碱性条件下氧化生成荧光物质的原理,进行荧光检测,通过对样品中毒素组分的定性定量分析,得出毒性检测结果。但是成本高、费时,且需要复杂的仪器设备及较高的分析技术。

我们知道PSP毒素的测定方法有多种，如小白鼠生物分析法、液相色谱/质谱法(LC/ MS)和衍生后液相色谱法。小白鼠生物分析法由于灵敏度和选择性有限,主要用于筛选分析。目前报道较多的是液相色谱法,但由于PSP 毒素分子本身生色基团很弱,不能直接用紫外或荧光检测,通常要将毒素分子的环结构氧化成荧光生色团,衍生(氧化) 过程包括柱前衍生和柱后衍生,荧光衍生化后用高效液相色谱-荧光检测法进行测定,操作比较繁琐,干扰大。液相色谱/ 质谱联用法由于能提供化合物结构信息,常常被分析工作者作为确证分析方法越来越多的应用于实际样品的分析,目前报道的多为采用离子阱和飞行时间质谱测定,这两类质谱仪定性结果准确,定量结果稍强人意。串联质谱由于同时具备准确定性和准确定量的特点,已经越来越多地用于分析确证方法。采用液相色谱-三级四极杆串联质谱联用技术,建立了同时测定各种食品中麻痹性贝类毒素的检测方法。处理简单,灵敏度高,用于实际样品取得较好的效果。

质谱的定性及质谱优化条件选择实验中发现,尽管对质谱条件和液相条件进行了优化,但是有个别质谱检测灵敏度仍然较低。因此,在液相与质谱联机后,采用仪器对雾化气流量,雾化室温度,喷雾针位置等参数做了进一步优化,使各种参数达到最佳状态。

2.2.3麻痹性贝类毒素ELISA快速检测方法

PSP由石房蛤毒素(STX)及其天然衍生物组成，是一种非

蛋白质的毒素，带胍基的三环化合物。近年来，随着沿海污染

的不断加剧，赤潮频发，导致我省连续数年发生食用织纹螺

PSP中毒死亡事件。目前，日本检测麻痹性贝类毒素大多采用

小鼠生物法，但该方法存在检测高度变异性、敏感性不高、假阳性率高、准确性和重复性差，不能断定个体毒素成分，尤其是对

实验动物的种系及体重要求苛刻的不足，限制了普及应用。高

效液相色谱技术(HPLC)敏感性较高、检出限较低、重复性较

好、检测速度快，但需要昂贵仪器和多种标准物质、前处理净化

操作繁琐等，能够开展的实验室非常少。上世纪8O年代末，建立了PSP的放射性免疫和酶联免疫

技术，但都因交叉反应不能充分检测所有毒素而未得到广泛的

应用。本研究应用德国R-Biopharm公司提供的抗STX和抗

neo—STX多克隆抗体竞争ELISA 试剂盒，特异性强、灵敏度

高、分析速度快、取样量小，简化了提取和纯化步骤，一次可同

时检验大量样品，1 h可以报告结果，对于食物中毒的快速检 测具有重要的现实意义。EuSA定量测定STX是在9O年代

初研制成功，我们检测灵敏度下限为50／~g／kg，结果能从织纹 螺毒性物质中分离出STX含量，有利于区别织纹螺毒性的差

异，方法具有较高的特异性，在基层应用可取得较理想的效果。

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