爱华网性负调节物的观点。在实验中，他们将番茄ＮＲｅＤＮＡ片段反向连于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子之后，用来转化３周龄的番茄Ｎｒ（Ｎｅｖｅｒｒｉｐｅ）突变体的子叶细胞，并在选择培养基上获得了４株转化植株。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析证实了转化植株中其中一株含有２个拷贝的反义基因，另外３株含有单拷贝的反义基因。对这些转化植株成熟果实的研究表明，含有２拷贝反义基因转化植株的果实能够正常成熟，并且变红的时间与野生型番茄一样；而含有单拷贝反义基因的转化植株的果实成熟后始终保持黄色，外观上类似于Ｎｒ（Ｎｅｖｅｒｒｉｐｅ）突变体的果实。通过对成熟相关基因（ＡＣＣ氧化酶基因和八氢番茄红素合成酶ｌ基因’）以及乙烯响应基因（Ｅ４）表达的研究发现，野生型番茄相对于Ｎｒ（Ｎｅｖｅｒｒｉｐｅ）突变体，含２拷贝反义基因的转化株相对于含单拷贝反义基因的转化株，这３种基因都具有较高的转录活性。而对转化植株中突变Ｎｒ基因的表达研究则显示。含单拷贝反义基因转化株中Ｎｒ基因的表达量都有不同程度的降低，而在２个拷贝反义基因的转化株中没有检测到Ｎｒ基因的表达。所有这些结果表明，ＮＲ基因的表达并非番茄果实正常成熟所必需。也就是说，在番茄果实正常成熟时，ＮＲ受体很可能是通过与乙烯结合失活后而使植物体表现出对乙烯敏感性的。否则，在检测不到ＮＲ基因产物时果实将不会成熟。因此，他们的研究结果不仅支持了乙烯受体抑制模型，而且也很好地解释了为什么拟南芥中只要５个受体蛋白之一丧失了对乙烯结合的能力就会导致显性的乙烯不敏感性突变体的产生。
１．３．７．４乙烯调节果实成熟相关基因的表达
伴随果实的成熟，乙烯被大量合成和释放．乙烯通过受体的识别及一系列信号转导过程最终产生生物学效应，具体表现在乙烯启动了许多成熟相关基因的表达，这其中也包括乙烯自我催化大量合成反应中相关基因的表达。如Ｏｅｔｉｋｅｒ（１９９５）研究提出：乙烯通过协调ＡＣＣ合成酶、ＡＣＣ氧化酶基因的表达，进一步启动了乙烯的自我催化合成过程。王永章等（２０００）对苹果成熟过程的研究发现，乙烯可以通过诱导中性转化酶、蔗糖磷酸合酶以及蔗糖合酶来调控果实中蔗糖的含量，结果在蔗糖合成与分解的动态中，合成明显占优势，这种趋势对果实食用品质的形成至关重要。
由于乙烯在果实成熟中的重要作用，多年来，通过调节乙烯生物合成以控制果实成熟进程的实践始终没有间断。上一世纪七十年代后，基因工程技术的发展和应用为果实成熟调控的研究注入了新的活力。
１．４番木瓜果实采后生理学及分子生物学研究
番木瓜果实是营养价值和经济价值较高的热带亚热带水果。近年我国番木瓜栽培面积和产量增加很快，但番木瓜采后贮运过程中存在两个主要问题：一是采后很快软化成熟，二是容易腐烂，造成采后损失严重，在台湾番木瓜采后损失可高达２３．７％（谢庆昌，２００１）。因此，对番木瓜果实采后生理的研究具有重要意义。
１．４．１番木瓜果实采后生理学的研究
１．４．１．１果实成熟过程颜色的变化
随着果实的成熟，果皮颜色变化的过程是由粉绿＿÷浓绿－÷绿一浅绿＿黄绿一出现黄色条斑一黄色扩大但果肉很硬＿黄色果肉变软（陈健，２００２）。Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ（１９９９）等将番木瓜成熟过程果皮色泽变化分为六个级别，１级：果色浅绿（绿熟）到果实表面转黄面积小于１／１０；此时果实营养物质已充分积累，绿熟阶段果皮带淡黄色，种子变黑，果实可正常后熟；当果实果棱上端开始刚出现１～２条黄色条纹时，称果实处于破色阶段；２级：果皮转黄面积多于１／１０，小于１／４；３级：果实表面１／４－－－－１／２转黄；４级：果实表面１／２＂－３／４转黄；５级：果实表面转黄面积大于３／４果面；６级：果皮皮色全部转黄到橙黄。
１．４．１．２碳水化合物的变化
番木瓜果实碳水化合物主要为蔗糖、葡萄糖和果糖。果实发育早期，糖的种类以葡萄糖为主。总糖含量与果重成正相关，果实在完熟期间转化酶活性增加，蔗糖降解为果糖和葡萄糖。番木瓜果实含少量淀粉，在果实发育期间变化很小，“Ｔｈａｉｌａｎｄ＂番木瓜淀粉含量在座果后１４０＂－－１６０天从０．１１％减少到０．９９％（Ｓａｎｋａｔ
１．４．１．３果实成熟软化相关酶的变化
番木瓜果实表面３／４转黄时，ＡＣＣ氧化酶（ＥＦＥ）活性最高。用离子探针分析发现ＡＣＣ氧化酶先在内果皮增加，然后是中果皮（Ｓａｎｋａｔ
番木瓜ＡＣＣ氧化酶、ＡＣＣ合成酶基因（Ｌｉｎｅｔｅｔａｌ，１９９７）。ａｌ，１９９７）。目前已克隆测序了Ｃｈｅｌａｅｔｅｔａｌ，１９９７；ａｌ，２００３）。Ｃｈｅｎ等指出番木瓜果实成熟过程中可能存在两条ＡＣＣ氧化酶调节途径，他们在番木瓜果实中发现了ＡＣＣ氧化酶基因ＣＰ．ＡＣ０２，与以前报道的在未成熟果实中就表达的ＡＣＣ氧化酶基因ＣＰ．ＡＣ０１不同，该基因在果实成熟后期才表达（Ｃｈｅｎ
１．４．１．４果实采后呼吸及乙烯变化
番木瓜属呼吸跃变型果实，呼吸跃变与果皮颜色变化相关，当果皮的果棱顶端开始转黄时出现呼吸跃变，呼吸跃变后乙烯的释放量出现一个高峰（Ｐａｕｌｌｅｔｅｔａｌ，２００３）。ａｌ，１９９７）。在２０。Ｃ下，果实呼吸强度（Ｃ０２）在果实刚破色时为９－１８ｍｇ／（ｋｇ?ｈ），完熟时呼吸强度增加约５倍，达到７０～９０ｍｇ／（ｋｇ．ｈ），果色破色前，乙烯及其微量，果实开始变软时，乙烯释放量出现高峰，完熟期乙烯释放量为７－１０¨ｇ／（ｋｇ?ｈ）（Ｐａｕｌｌ，１９９６）。
１．５本研究的目的和意义
番木瓜属呼吸跃变型果实，因此采后贮运过程中一直存在两个主要问题：～是采后很快软化成熟，二是容易腐烂，造成采后损失严重。基因调控在果实的成熟的过程中起着重要的作用，本研究通过ＲＥＡＬ－ＴＩＭＥＰＣＲ技术，分析番木瓜果实成熟过程中基因表达的差异，可以帮助我们了解调控番木瓜果实成熟基因的表达规律，为进一步了解番木瓜成熟过程中的基因调控打下基础。
１．６技术路线
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