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在构图上，达·芬奇改变了以往画肖像画时采用侧面半身或截至胸部的习惯，代之以正面的半身像构图，透视点略微上升，蒙娜丽莎双手交握，平行于画面底边，胳膊肘处在画面的两角，人的整个姿态形成金字塔构图。拉斐尔等人都曾模仿过这种构图。当然这在今天也仍有借鉴意义。
坐姿时，可以让模特把手放在椅子把手上;站立时，让模特手捧一束花，稍微侧立都可以有效地形成金字塔构图。另外让人物会尽可能地填满画框，避免过多背景分散观者注意力。
还有一个不能忽略的元素是，达·芬奇把蒙娜丽莎的眼睛安排在和观者平视的角度。这样，观众就会觉得是在直视蒙娜丽莎，而不是我们在仰视她或她在仰视我们。
法国工程师帕斯卡尔·科特利用自己设计的高清晰数码相机(包括紫外线和红外线等技术手段)为《蒙娜丽莎》拍摄了一幅2.4亿像素的超高清晰度照片。照片每英寸像素达到15万，也就是说，照片上蒙娜丽莎的面部大小是画作上的24倍。
科特认为蒙娜丽莎本人的肤色应该是暖粉色，她身后的天空应该是生动的蓝色，而不是现在人们所看到的灰绿色。科特认为，画面目前展现出的深绿色背景是500年岁月中油墨颜色沉淀的结果。 吸引视线第二步：渐隐背景突出主体
现在看来习以为常的大光圈、浅景深在当时可算是革命性地创新。因为当时的画家都喜欢让主题和背景都有丰富的细节──而蒙娜丽莎的背景则有些渐隐的效果，远处的景色在焦点之外，也就是我们现在常说的景深。不过可以看到达·芬奇并没有使用“最大光圈”，背景只是渐隐而没有彻底模糊，这在突出主体和交代背景之间做了较好的平衡。
此外，关于背景还有值得我们注意的：不是大家经常讨论的背景是否完全垂直对称，也不是关于背景是否来自于画家的臆想;而是背景的颜色，它是轻柔且温和的，不会有喧宾夺主的问题。
