多肽保存 多肽 多肽-简介,多肽-保存方式

多肽保存 多肽 多肽-简介,多肽-保存方式

多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10,000Da(Dalton道尔顿),能透过半透膜,不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽);10~50个氨基酸组成的肽称为多肽;由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

多肽_多肽 -简介

肽(peptide)是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物。


活性肽

一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼:由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽,它们的分子量低于10,000Da(Dalton,道尔顿),能透过半透膜,不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽);10~50个氨基酸组成的肽称为多肽;由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,换言之,蛋白质有时也被称为多肽。

多肽也简称为肽,是20世纪被发现的。

多肽的分类

多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。

多肽的种类

细胞因子模拟肽

利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽,近年成为国内外研究的热点。国外已筛选到了人促红细胞生成素,人促血小板生成素,人生长激素、人神经生长因子及白细胞介素等多种生长因子的模拟肽,这些模拟肽的氨基酸序列与其相应的细胞因子的氨基酸序列不同,但具有细胞因子的活性,并且具有分子量小的优点。这些细胞因子模拟肽正处于临床前或临床研究阶段。

抗菌性活性肽

当昆虫受到外界环境刺激时产生大量的具有抗菌活性的阳离子多肽,已筛选出百余种抗菌肽,体内外实验证实,多个抗菌肽不仅有很强的杀菌能力还能杀死肿瘤细胞。例如,从蚕体内筛选的抗菌肽D表现了很好的应用前景,并能利用基因工程技术生产。蛇毒内也存在多种活性多肽,从蛇毒内分离出一个13个氨基酸(INKAIAALAKKLL)小肽,其对G+及G-菌均有极强的杀菌能力。

用于心血管疾病的多肽

很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用,不仅可用作药物,亦可用作保健食品。但由于其作用成份不能确定。其应用受到很大限制。现已发现很多有效成分是小分子多肽,比如我国科学家从大豆内加工分离出的活性多肽,可通过小肠直接吸收,能防治血栓,高血压和高血脂,还能延缓变老,提高肌体抗肿瘤力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。

其它药用小肽

小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外,在其它很多领域也取得一些进展。比如stiernberg等发现一个合成肽(TP508)肽能促进伤口血管的再生,加速皮肤深度伤口的愈合。Pfister等发现一个小肽(RTR)4能防止碱损伤角膜内炎症细胞的侵润,抑制炎症反应。Carron等证实其筛选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。

诊断用多肽

多肽在诊断试剂中最主要的用途是用作抗原检测病毒、细胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥虫等寄生虫的抗体,多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强,且易于制备,因此装配的检测试剂,其检测抗体的假阴性率和本底反应都很低,易于临床应用。现在用多肽抗原装配的抗体检测试剂包括:甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿等。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白内分析筛选获得,有些是从肽库内筛选的全新小肽。

活性肽种类

免疫活性肽、神经活性肽、其他活性肽等。

其他活性肽包括:胆固醇肽、促进矿物质吸收的肽(CPPS)、酶调节剂(如促胰酶肽)、激素肽如生长激素释放因子(GRFS)、白蛋白胰岛素增效肽、抗菌多肽(如乳酸链球菌素、橡胶素)、抗癌多肽(如肿瘤细胞坏死因子、环已肽)、抗艾滋病肽(如GLQ蛋白)等。

活性肽特性

生物提取的多肽具有很强的活性,所以叫做活性肽!只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的,是需要筛选的,只有活性肽才能被人体安全使用!

对人体影响

活性肽主要控制人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢,它在人体处于一种平衡状态,若活性肽减少后,人体的机能发生重要变化,对于儿童来说,他的生长、发育变得缓慢,甚至停止,长久下去就形成了侏儒,对成年人或老年人,缺少活性肽后,自身的免疫力就会下降,新陈代谢紊乱,内分泌失调,引起各种疾病的产生,如失眠、身体消瘦或浮肿。由于活性肽还作用于神经系统,因此人体就会变得动作迟缓,头脑不再聪慧,更主要的是活性肽减少,直接引起人身体各部位逐渐出现全面衰老,引发各种疾病。

分泌周期

在不同的年龄时期,各种活性肽的分泌量也有很大差别,按分泌量划分,人的一生一般可分为:

①分泌充足期(25岁以前的青年期)这个时期内分泌量均衡、免疫功能强劲,人体一般不易出现疾病;

②分泌不足期(失衡期)(30―50岁壮年和中年期)这一时期如果活性肽分泌不足或失衡会出现各种相关的亚健康状态和轻微疾病症状(40岁以上的人群常见);

③分泌匮乏期(严重不足期)(50岁以上中年和老年期)这一时期严重如果活性肽严重不足和严重失衡,可能出现非常突出的衰老症状,或会引起各种相关疾病发生(50岁以上人群比较明显);


多肽的组成

④分泌终止期(衰老期),这一时期很短,由于控制人体内分泌的“司令官”活性肽不分泌或分泌减少,从而导致细胞功能衰退,引发器官功能衰竭和丧失,最后导致生命终结。多肽

由多个分子α-氨基酸的-NH2与-COOH互相缩合失水后形成10个肽键(-CONH-)以上的长链化合物。它包括多种在人的机体中具一定生理活性的化合物,可以从动物组织中提取,也可能人工合成。蛋白质即是以各种氨基酸按一定顺序以肽键形成的长链肽,通过多种次级键交联结合而成的高分子化合物,蛋白质具有复杂的四级结构,通过不同程度的水解,破析结构可得包括多肽等的产物:蛋白质→蛋白脉(proteose) →蛋白胨(peptone) →多肽→寡肽(oligopeptide,2~10个肽键的长链肽) →氨基酸。这同时也表明了蛋白质的合成途径。因此,借人工合成多肽,不仅可用于生化制药工业,还可用来研究阐明蛋白质的合成途径及其结构。

肽对人体的重要性

人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域,其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能,激活体内有关酶系,促进中间代谢膜的通透性,或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成,最终产生特定的生理效应。肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质。肽可以合成细胞,并调节细胞的功能活动。肽在人体作为神经递质,传递信息。肽可在人体作为运输工具,将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织。肽是人体重要的生理调节物,它可全面调节人体生理功能,增强和发挥人体生理活性,它具有重要的生物学功能。肽对人的细胞活性、功能活动、生命存在太重要了。但现代人因各种因素使人体中的肽流失、损失,合成肽的能力大大减弱,因此现代人体缺乏肽,必须补充人工合成肽,补肽就是补活性,补肽就是补活力,补肽就是补生命。(摘自 酶法多肽专家邹远东教授 《酶法多肽论》)

多肽_多肽 -保存方式

多肽类保健食品只需置于阴凉干燥处即可。

对于多肽试剂和多肽类药物则需要保存在干燥器中。在将它们暴露于空气之前, 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。对于含Cys, Met orTrP的多肽试剂,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽试剂易被空气氧化,在封瓶前,慢慢流过多肽试剂的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽试剂也容易降解,所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比,生命期有限。

多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外,这点都会发生, 在有多重疏水残基的肽中更显着。盐会促进二级结构形成。我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽。如需要增加溶解率, 可用声处理。溶解仍有问题, 加少量稀乙酸(10%)或氨水,会便于溶解。

要长期保存多肽试剂, 最好冷冻干燥,冷干粉可在-20℃或更低存放几年而很少或无降解。溶液中的多肽远不稳定。 多肽易受细菌降解,应用无菌纯化水溶解。

含有Met,Cys或Tyr残基的多肽溶液由于氧化,寿命有限。应溶于无氧溶剂, 为防止重复冻融的破坏, 建议溶解过量的肽的便实验,其余多肽以固体形成保存。

多肽_多肽 -溶解性

大多数肽的首选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽, 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitrnle来溶解,这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。

残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。

多肽_多肽 -生产方法

发展历程


多肽固相合成法

随着科技的发展,生产肽的方法也在不断发展。五六十年代,主要是从动物脏器获取肽。如胸腺肽,其生产方法是将刚生下来的小牛宰杀之后,割下其胸腺,然后用震荡分离的生物技术,将小牛胸腺中的肽震荡分离出来,制

成胸腺肽针剂。这种胸腺肽主要用于人体免疫。现如今,这种肽已处于淘汰状态。世界上曾经一度流行的“疯牛病”,这种病毒主要吞噬动物大脑中的蛋白质,破坏其脑组织、细胞及神经。人体一旦染上此病毒,比患上癌症还可怕,最终成为“植物人”或很快死亡。还有从人体血液中提炼出来的肽 ,其副作用也很大,它不仅容易使人体染上甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、艾滋病毒、性病病毒,而且有排异过敏反应,这种反应一旦出现,生命就危在旦夕。

几种方法

固相合成法、液相合成法

用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就有一家。他们主要是购买世界上一些精细化工厂生产的氨基酸为原料定向合成某种单肽,属医药原料中间体,主要用于西药配方,以增强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率。

酸解法或碱解法

这种肽主要出现在日本。用酸解法生产的“大豆多肽”,属“食品添加剂”,主要用于老人和儿童食品,其目的是增强这两种人群对食品营养的吸收。世界上拥有“大豆多肽”的国家只有日本和中国。但其所用的原料、水解法和产品性质大有不同。日本所用原料是豆粕,水解方法是酸法,生产的肽酸性化学物质难以除尽,而且有苦味,需用活性炭吸附、脱苦,而活性炭免不了会侵入肽体。

酶法生产的生物活性肽

酶法生产的生物活性肽。这种肽主要产在中国,代表着当今世界肽研究、开发、生产、创新的水平和潮流。酶法生产的生物活性肽是用人体所需要的食品级植物蛋白酶,将人体平常所食的食物蛋白质酶解成小分子活性多肽。它具有极强的生物活性和多样性,已在世界范围内引起关注,成为当今世界追崇的热点。如武汉九生堂生产的“大豆多肽”,所用原料是含量在90%以上的大豆分离蛋白,水解方法是酶法,所用的酶属食品级植物蛋白酶。生产的“大豆多肽”无苦味,且风味芳香宜人,对人体无任何毒副作用。产品属终端产品,被中国创新基金列为无偿资助项目,已实现工业化生产,其终端产品“大豆多肽”口服液是世界上第一个用酶法生产的大豆多肽终端产品,在第89届广交会上受到世界客商的青睐。

多肽_多肽 -合成过程


多肽合成

具体合成由下列几个循环组成:

除去保护

Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去 除氨基的保护基团。

激活和交联

下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活。化学工艺常用HBTU/HCTU/HITU/HATU+NMM/DIPEA或HOBT+DIC作激活剂,激活的单体 与游离的氨基反应交联,形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反 应完成。循环:这两步反应反复循环直到合成完成。 氨基酸缩合结束后,可用适量TFA进行洗脱,根据起酸碱性,可选择10%TFA/DCM溶液,至100%TFA,以此类推。(注:此种方法为个人合成经验,并无文献资料可查;可根据需要进行参考。知识有限,望谨慎参考)

HPLC分析和纯化


高效液相色谱hplc流程示意

分析HPLC使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。

HPLC分两类:离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用,通过可变PH, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常, 先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。

反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱, 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的, 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显着差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。


青蒿素hplc法检测图谱

典型的操

作常由两绶冲剂组成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)

大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨,TFA/TEA,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH,甚至微碱pH, 因为这样会破坏柱子。

不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%, 而肽含量相关带电基团(如Arg, Lys )的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。

多肽_多肽 -酶法多肽

概述

酶法多肽是以蛋白酶降解蛋白质获得的多肽。

以蛋白酶对卵蛋白、乳蛋白、酪蛋白、鱼蛋白、昆豆蛋白等动物蛋白降解获得的多肽豆有促进、增强、调节免疫的生理功能。此类酶法多肽服食进入循环系统和人体组织后,能刺激机体的免疫系统发生特异性免疫反应。

多肽进入人体后,可作为抗原,不需要T细胞的辅助就能直接刺激B细胞产生抗体。但多肽进入人体后,可诱导和促进T细胞分化、成熟;刺激B细胞产生并分泌免疫球蛋白(抗体)参与人体免疫反应;提高自然杀伤细胞(NK)活力,在无抗体参与的情况下,杀伤肿瘤细胞,发挥广谱抗肿瘤、抗感染作用,参与免疫调节;刺激K细胞杀伤不易被吞噬的病原体,如寄生虫、恶性肿瘤细胞等;刺激N细胞的杀伤能力;刺激吞噬细胞的吞噬能力,主要提高其吞噬消化功能、分泌功能,参与免疫应答、免疫调节过程,并抗感染、抗肿瘤;增强红细胞免疫功能;提高白细胞介素-2(1L-2)的产生水平和受体表达水平;增强外周单核细胞Y-干扰素的产生;增强血清中SOD活性;可显着增加淋巴细胞功能;能有效防止辐射核放化疗及空气、水、食物、环境污染中毒豆白细胞的减少;能有效抑制肿瘤细胞的生长;可防止恶性肿瘤放化疗引起的CD4+降低。总之,酶法多肽是可食免疫剂,可全面增强人体免疫功能和免疫调节,是一种现代新型免疫剂,是现代免疫的珍品。

起源

用生物酶催化蛋白质的方法称为酶法,用生物酶催化的方法催化蛋白质获得的多肽叫做“酶法多肽”。

酶法多肽一词最早起源于1996年,多肽科学家邹远东用生物酶催化蛋白质获得多肽取得了巨大成功。当年,人民日报海外版对外报道这一消息,引起了世界关注,之后得14年内,中国中央主流媒体相继将邹远东作为中国自主创新的重大典型予以报道,2006年《光明日报》以《邹远东与他创立的酶法多肽》为题,连续三天进行了专题连续报道;《科技日报》以《邹远东自主创新酶法多肽》为题用整版8000字的篇幅报道了邹远东;新华社新华网、《人民日报》人民网、中央电视台央视网、中央人民广播电台中国广播网、《解放军报》中国军网、中国科学院网、中国疾病控制中心网、《中国医药报》、《中国知识产权报》均在突出位子重点报道了邹远东自主创新酶法多肽的事迹。酶法多肽为此而叫响、为此而成名。

特点

传统获得肽的方法有很多。传统法主要有:酸法、碱法、电法、人工嫁接法、基因表达法等。但在工艺技术方面,这些合成工艺方法的局限性,是导致其这些合成方法没有产品的原因。

而酶法在传统法的基础上有所突破和创新,适应了低碳经济和绿色环保的要求。酶法就是用生物酶催化蛋白质获得多肽,就是蛋白质降解,人工合成的多肽。酶法较酸法、碱法、电法温和、环保。生产工艺简易,投资少、见效快,适宜工业化生产,其代表产品有三九蛋白肽、九生牌苦瓜多肽等。

酶法获得多肽,分子量易控制、产品自身富有绿色属性、生产出来的肽无苦味、肽分子量小(分子量大都在1000以下)、这些小分子肽不需消化直接吸收,具有动力、载体、运输、递质和营养功能,特别是它具有极强的活性和多样性即重要的生物学功能。

  

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