爱华网分子印迹技术及其应用研究进展
1 分子印迹技术的起源与概况
分子印迹技术也叫分子模板技术，最初出现源于20世纪40年代的免疫学，当时
Pauling首次提出抗体形成学说［1］，要点是抗体在形成时其三维结构会尽可能地同抗原形成多重作用位点，抗原作为一种模板就会“铸造”在抗体的结合部位。后来“克隆选择”理论否定了这一学说。尽管如此，它却为分子印迹理论的产生奠定了基础。从那时起，科学家对生物分子天然识别的模拟研究产生了浓厚兴趣，并由此对分子印迹进行了各种尝试。1972年WulffG研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物（molecular imprinted polymers，简称MIPs）［2］，使这方面的研究产生了突破性进展。但由于他的研究主要集中在共价型模板聚合物上，动力学过程较慢，其应用仅限于催化领域，而在分子识别领域的应用没有展开。80年代后非共价型模板聚合物的出现，尤其是1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展，并由此使其成为化学和生物学交叉的新兴领域之一，得到世界注目并迅速发展。目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事MIPs的研究和开发［3］。
2 分子印迹技术的原理与特点
2.1 分子印迹技术的原理与步骤
分子印迹技术一般包括以下3个步骤：（1）在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子（TemplateMolecule，即印迹分子）与功能单体（FunctionalMonomer）依靠官能团之间的共价（Covalent）或非共价（Noncovalent）作用形成主客体配合物（Hostguestcomplex）；（2）加入交联剂（Crosslinker），通过引发剂(Initiator)引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高交联的刚性聚合物；（3）将聚合物中的印迹分子洗脱（extraction）或解离（dissociation）出来，这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统。
目前,分子印迹的发展有3个基本趋向：(1)预组装方式。主要由WulffG及其同事创立［4］。在此方法中，印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，聚合后再打开共价键去除印迹分子。（2）自组装方式。主要由Mosbach及其同事创立［5］。在此方法中印迹分子与功能单体之间预先自组织排列，以非共价键如氢键作用、静电作用、π-π作用、疏水作用、金属-配体作用、电荷转移等超分子作用形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。（3）将共价作用与非共价作用相结合［6］，应用于制备MIPs。另外还有用金属络合物、离子键等方法制备MIPs的报道。这里主要对共价键法和非共价键法作一介绍。
2.1.1 共价键法（预组装方式）
印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，所采用的单体通常是低分子的化合物，此单体与印迹分子形成的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合后又能完全脱除。目前，使用较多的共价作用包括硼酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯和螯合键合作用。其中最具代表性的是硼酸酯。但由于共价作用一般较强，在印迹分子预组装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡，不适合于快速识别，并且识别作用机理与生物识别相差甚远，因此这种方法发展缓慢。
2.1.2 非共价键法（自组装方式）
非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。这些非共价键包括静电引力（离子交换）、氢键、金属螯合、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。其中最重要的类型是离子作用，其次是氢键作用。但在制备MIPs及其后续过程中，一般来讲，使用单一的作用方式制得的MIPs的选择性较低，因此大多使用多种作用相互结合来制备具有高选择性和分离能力的MIPs。由于非共价键法使用超分子作用制备仿生模型，其分子识别机理类似于天然生物分子，因此是分子印迹技术的研究热点，发展很快。
2.2 分子印迹聚合物的合成材料与制备方法
2.2.1 模板分子的选择
制备非共价型印迹聚合物几乎对模板分子没有限制，碳水化合物、有机胺类、羧酸类、甾醇类、氨基酸、核酸、蛋白质乃至金属离子均可被用于制备MIPs。但是更大分子如细胞［7］、金属晶体作模板分子，虽有报道，但制备仍有一定困难。一般地，分子中含有强极性基团的化合物易于制备高效能的MIPs。由于氢键具有方向性和饱和性，作用力较强，因此能与功能单体间形成氢键的印迹分子往往能制备高选择性能的MIPs。
2.2.2 溶剂的选择
非共价型MIPs中，反应溶剂对分子间作用力和MIPs的形态影响很大。溶剂还起着致孔剂的作用。所用溶剂对印迹分子不但应具有较高的溶解度，最好还能够促进印迹分子与功能单体间的相互作用，至少不干扰这种效应。所以必须根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜的溶剂。
一般地，极性强的溶剂会降低印迹分子与功能单体间的结合,特别是干扰氢键的形成，生成的MIPs识别性能较差,故应尽可能采用介电常数低的溶剂,如苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷等。但是,也有作者采用乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯甚至甲醇、乙醇及醇和水的混合液做溶剂合成MIPs,此时印迹分子与功能单体主要依靠疏水作用结合。受溶剂影响,在分析中MIPs可能发生溶胀,致使结合位点的三维结构发生改变,对分析物的识别作用减弱。为避免溶胀发生,吸附中所用的溶剂最好与聚合反应溶剂一致。
2.2.3 功能单体的选择
制备共价键型印迹聚合物通常使用的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚和二醇以及含有硼酸酯的硅烷化合物等。如4-乙烯基苯硼酸、4-乙烯基苯甲醛、4-乙烯基苯胺及4-乙烯基苯酚等。由于硼酸和邻二醇基团形成的酯键可逆性好，易于形成和断裂，故4-乙烯基苯硼酸单体在糖类衍生物异构体分析中占有重要的地位。
非共价型印迹聚合物使用的单体有丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、三氟甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、丙烯酰胺、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基苯乙酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、1-乙烯基咪唑、4-乙烯基吡啶、2-乙烯基吡啶、2，6-二丙烯酰胺吡啶、N-丙烯酰胺基丙氨酸、N-（4-乙烯苄基）亚氨基二乙酸铜（II）、β-环糊精和含乙烯基L-缬氨酸的衍生物等。最常用的功能单体是α－甲基丙烯酸，其分子内除具有一个碳碳双键外，还具有一个羧基，可以以离子键与胺发生作用，也可以以氢键与酰胺、氨基甲酸酯和羧基化合物发生作用。另外,采用天然生物分子如蛋白质制备MIPs,称为蛋白质印迹技术(molecularimprinting ofproteins)。Dabulis［8］等用苹果酸印迹小牛血清蛋白,获得了特异性的蛋白印迹聚合物。2.2.4
交联剂的选择
制备MIPs目前最常用的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）,主要是因为其价格便宜，容易纯化，而且制备的分子印迹聚合物性能稳定。除此之外，N，N’-亚甲基二丙烯酸胺、N，N’-1，4-亚苯基二丙烯酰胺、3，5-二丙烯酰胺基苯甲酸、二乙烯苯、L-2二丙烯酰胺基苯丙醇丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯（PETRA）、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）等也是常用的交联剂。
2.3 分子印迹聚合物制备的链引发方式和聚合方法
2.3.1 链引发方式
MIPs制备过程中的聚合反应是通过自由基引发的，一般以偶氮二异丁腈（AIBN）或偶氮二异庚腈为引发剂。常用的引发方式有光照、加热、加压、电合成等。低温光引发应用最为普遍，其中又以紫外光的能量适中而应用最多。热引发也较为常见，但此法对热不稳定的化合物不适用。
2.3.2 聚合方法
聚合的方法有封管聚合、原位聚合、悬浮聚合、表面印迹、膜制备技术等多种，但目前大多数制备采用封管聚合的方法，即将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂（通常是氯仿或甲苯）中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声波脱气，通氮气除氧，在真空下密封安培瓶，经热引发（60～120℃）或紫外光照射（在室温下波长通常为366nm）引发聚合一定时间（通常是24h）得到块状聚合物。经粉碎、研磨、筛选等过程获得适度大小的粒子，洗脱除去模板分子，经真空干燥后即成。该方法制备的MIPs具有满意的“记忆功能”，对印迹分子有良好的选择性和识别特性，而且合成操作条件易于控制，实验装置简单，便于普及。其缺点是粉碎、研磨、筛选等预处理手续繁琐。而且最终得到的聚合物粒子均匀度较差，制备率也较低（为总量的50％左右）。其它方法各有优劣，限于篇幅，在此不一一介绍。
2.4 分子印迹技术的特点
由上可见，MIPs有三大特点：（1）预定性（predetermination），即它可以根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足各种不同的需要；（2）识别性（recognition），即MIPs是按照模板分子定做的，可专一地识别印迹分子；（3）实用性（practicibility），即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟，但由于它是由化学合成的方法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。
3 分子印迹技术的应用
目前分子印迹聚合物以其优良的性能已经在生物、化学、医学等领域得到广泛的应用。
3.1 用于化学仿生传感器
化学或生物传感器是由分子识别元件和信号转换器（如电极、光极、场效应晶体管、压电晶体、热敏电阻等）所组成。近几十年来，生物传感器以其突出的灵敏度和特异性引起了广泛的关注，使传感器技术的研究不断升温。与生物识别元件相比，分子印迹聚合物具有专一性强，稳定性好，不需使用动物，可大规模生产等优点。目前用MIPs膜传感器测定的对象有氨基酸衍生物、吗啡、除草剂、有机溶剂、神经毒剂水解产物、金属离子等。将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，然后通过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号，可定量分析各种小分子有机化合物。
3.2 膜技术
Mathew-Krtoz J 和Shea KJ［9］报道了选择性运输和分离中性分子的模板聚合物膜的制备技术。以9-乙基腺嘌呤为模板，将反应混合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液涂在硅烷化的玻璃切片上，在65～70℃和氮气保护下聚合制备出MAA和EDMA基体的聚合物膜，用甲醇洗去模板分子，在一个H型双层液池中进行膜运输实验，结果表明腺嘌呤的流通量明显大于胞嘧啶和胸腺嘧啶，腺苷的流通量大于鸟苷，这种运输是腺嘌呤和膜中结合位点可逆结合和交换的结果。而且膜的稳定性和机械强度明显优于生物膜。这是分子印迹技术在生物膜仿生中一个突破性进展，给分子印迹聚合物的研究增添了新的生命力。
3.3 天然抗体模拟
MIPs模拟天然抗体具有很大的优越性［10］。不需实验动物和免疫技术，可耐酸、碱、高温、高压环境及有机溶剂，且可回收多次利用。Mosbach等用MIPs代替抗体在RIA测定中检测药物中的吗啡、茶碱等，取得了与单抗相似的交叉反应。
3.4 选择性催化剂
因为分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性中心，因此具有模拟酶催化作用。通过选用适当的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结合的结合位点和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定排列。模板聚合物作催化剂时，许多情况下与用酶作催化剂相似，符合米氏方程动力学。
3.5 用于色谱固定相
MIPs最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物。其使用的印迹分子范围广阔，无论是小分子（氨基酸、药品和碳氢化合物），还是大分子（如蛋白质），都已经被用于各种印迹技术中，并用于HPLC、TLC和CE分离中。分子印迹聚合物作为色谱固定相广泛应用于拆分外消旋体。WulffG首先把分子印迹聚合物作为HPLC的固定相拆分模板α-D-甘露吡喃糖苯苷的外消旋体［11］。此外在非手性分子的识别分离方面也有了新的进展。SheaKJ等使用9-乙基腺嘌呤为模板制得的印迹聚合物用于HPLC固定相，对模板分子选择性极高，类似于经过多步制得的低分子量的受体的选择性。许多其他研究还分别报道了睾丸酮［12］、胆固醇［13］、唾液酸［14］等分子印迹聚合物分离模板分子与其类似物。
3.6 固相萃取剂
分子印迹聚合物具有特效的选择性和亲和性，用作固相萃取剂，可克服生物或环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素，为样品的采集、富集和分析提供了极大的方便，可用于医药、食品和环境分析样品的制备，对于痕量分析有重要作用。印迹聚合物既可以在有机溶剂中使用，优化条件下又可在水溶液中使用，与其它萃取过程相比，具有独特的优点。SellergrenB［15］首次报道将分子印迹用于固相萃取，他以pentamidine（PAM，AIDS抑制药）为模板制备PAM分子印迹聚合物，进行固相萃取，取得了很好的效果。
3.7 药物手性分离
随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的有效成分往往具有不同的手性性质，尽管分子式相同，但其药效不同，甚至相反。因此有必要采取适当方法对其对映体或异构体进行拆分。Kempe等人［16，17］以（S）-naproxen（萘普生）为模板分子制备MIPs对其消旋混合物拆分，得到较好的效果，分离度为0.83。另外，这种聚合物还可将（S）-naproxen与其结构类似物Ibuprofen（布洛芬）和Ketoprofen（酮洛芬）进行分离。南开大学化学学院分析化学研究室何锡文等利用分子印迹法对药物扑热息痛［18］、头孢氨苄［19］、氟哌酸［20］等分子印迹聚合物的合成和结合选择性进行了报道；董襄朝等利用分子印迹技术对麻黄碱、水杨酸、氧氟沙星等药物的分离效果作了系列研究，取得了较大进展。
3.8 药物控制释放
印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质,可以被用来作为一种反应性控制释放载体。有人通过实验,初步提出了药物控制释放机理,以某种印迹分子为模板制得的印迹高聚物载着一定量的与该种印迹分子结构相似的药物分子,这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。可以想象,这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后,如果人体内存有该种印迹分子,则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附,从而导致药物分子的逐步释放。当然，该高聚物应是可体内降解的。
3.9 农残分析
Bjarni Bjarmason等［21］、JunMatsui等［22］分别合成了以阿特拉津为模板的分子印迹聚合物，对氯代三嗪类除草剂进行富集提取，取得较好的效果（提取效率74%～77%）。ImmaFerrer［23］利用特丁津印迹聚合物对环境水和底泥样品中的微量氯代三嗪类农药（去异丙基阿特拉津、去乙基阿特拉津、西玛三嗪、阿特拉津、扑灭津、特丁津）进行选择性富集，除扑灭津外（回收率为53%），所有的三嗪类化合物回收率都高于80%，表明该聚合物具有较高的选择性。
4 分子印迹技术存在问题与展望
尽管目前分子印迹技术发展的速度比较快,而且也得到比较广泛的应用,但仍然存在许多问题。首先，分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题、结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理仍然是研究者们所关注的问题。如何从分子水平上更好地理解分子印迹过程和识别过程,仍需努力。其次,目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性。尤其是功能单体的种类太少，以至于不能满足某些分子识别的要求,这就使得分子印迹技术远远不能满足实际应用的需要。第三,目前分子印迹聚合物大多只能在有机相中进行聚合和应用,而天然的分子识别系统大多是在水溶液中进行的,如何能在水溶液或极性溶剂中进行分子印迹和识别仍是一大难题。第四,目前能用于分子印迹的大多是像药物、氨基酸和农药这样的小分子,而像多肽、酶和蛋白质这样的大分子虽有报道,但并不多见。
综上所述，分子印迹技术作为一种新兴的化学分析技术，已经引起普遍关注，我们相信，随着人们进一步的研究与开发，必将在以上领域取得新的进展
