爱华网重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细 胞的影响 陈 炜1,3，周克夫2，栗 华3* （1. 福建中医药大学研究生院，福建 福州，350108；2. 厦门大学环境与生态学院，福建 厦门，361005； 3. 厦门大学附属第一医院，福建…
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重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细
胞的影响
陈 炜1,3，周克夫2，栗 华3*
（1. 福建中医药大学研究生院，福建 福州，350108；2. 厦门大学环境与生态学院，福建 厦门，361005；
3. 厦门大学附属第一医院，福建 厦门，361005）
摘要：为观察不同时期应用重组胸腺素α原（ProTα）对肝癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响，并研究其对Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响，将36只KM小鼠随机分成空白组、荷瘤组、药物干预组，H22肝癌细胞皮下移植建立荷瘤小鼠模型，腹腔注射重组ProTα，观察7 d、14 d后对肝癌小鼠的抑瘤率，并检测外周单个核细胞中调节性T细胞的比例和NKG2D阳性细胞情况。结果表明：移植瘤7 d后，重组ProTα干预组和荷瘤组瘤重对比无显著差异。移植瘤14 d后，药物干预组瘤重较荷瘤组对比有显著差异。荷瘤14 d后，荷瘤组较空白组Treg细胞比例升高，NKG2D阳性细胞比例下调，差异显著。不论是重组ProTα干预14 d组还是进展期药物干预组，Treg细胞比例均明显降低，NKG2D阳性细胞明显升高，统计学差异显著。由此可见，重组ProTα能够抑制肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长，并且早期、长期用药效果更好，相关作用机制涉及下调Tregs数量从而抑制肝癌细胞免疫逃逸，并上调NKG2D阳性细胞提高其介导的抗肿瘤效应。 关键词：重组胸腺素α原；肝癌；调节性T细胞；NKG2D
中图分类号：R 735.7 文献标志码：A
1995年，Sakaguchi等[1]发现回输CD4+CD25+T细胞可以阻止裸鼠自身免疫疾病发生，Sakaguchi将这一类具有抑制机体免疫功能的细胞命名为调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）。大量研究发现，调节性T细胞广泛存在于各种肿瘤微环境中[2-4]，并且与肿瘤的预后呈负相关[5]。张蘋等发现肝癌荷瘤小鼠脾脏、引流淋巴结中CD4+CD25+Tregs比例较对照组升高，且Tregs数量的高低与肿瘤大小呈正相关[6]。NKG2D是NK细胞的活化受体，除了NK细胞外，NKG2D还表达于活化的CD8+T细胞、γδT细胞。NKG2D与特异性配体结合，发挥免疫应答和免疫监视作用。目前已知的配体主要是组织相容性复合体（MHC）I类和UL16结合蛋白家族（ULBP），包括MICA、MICB、ULBP1-4等[7-8]，此外，组织相溶性抗原60、视黄酸早期转录因子1也参与NKG2D的免疫调控[9]。NKG2D配体主要表达在受感染细胞和恶性肿瘤细胞表面，健康细胞很少表达。在肿瘤细胞和效应性T细胞表面，Groh等发现NKG2D与可溶性配体MIC结合后发生内化降解，导致效应T细胞抗肿瘤作用减弱[10]。Tomohiro等发现在胃癌患者体内，CD8+T细胞表面NKG2D的表达显著下调，并且NKG2D的表达与癌组织的侵润深度呈负相关，进一步的体外实验证实，加入MICA抗体可以阻止NKG2D的下调[11]。 收稿日期：2015-12-16 录用日期：2016-02-16
基金项目：福建省创新课题（2009-CXB-51）；福建省自然科学基金（2013J01383）
*通信作者：endohlihua@126.com
胸腺素α原（Prothymosin α，ProTα）分布于哺乳动物各种组织，胸腺和脾脏中含量较高。内源性的ProTα具有促进细胞增殖的作用，并参与细胞凋亡和肿瘤生长的调控。外源性ProTα具有较好的增强机体免疫和抗肿瘤作用，它能够促进IL-2、TNF-α、IFN的分泌，刺激肿瘤特异性T淋巴细胞产生，发挥抗肿瘤作用[12-14]。我们前期的研究证实[15-16]，重组胸腺素α原对于荷瘤及癌性腹水小鼠肿瘤生长和生存周期有较好的改善作用，但其对肝癌荷瘤小鼠Treg细胞和NKG2D表达的影响尚未清楚。本实验通过早期及进展期用药干预，观察重组ProTα对荷瘤小鼠抑瘤率的影响，并研究其对肝癌荷瘤小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞是否具有调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物为雄性KM小鼠，5~6周，SPF级，共36只，购买于厦门大学实验动物中心。小鼠H22肝癌细胞由厦门大学附属第一医院肿瘤实验室保种。
1.2 主要试剂及仪器
重组胸腺素α原[17]（厦门大学环境与生态学院周克夫教授及厦门伯赛因公司联合提供）、Treg细胞流式染色试剂盒（美国ebioscience）、PE-antiCD314抗体（美国ebioscience）、淋巴细胞分离液（天津灏洋有限公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，实验室自配）、流式细胞仪（型号：BD LSRFortessaTM）。
1.3 实验方法
1.3.1 移植瘤小鼠的构建
取出H22细胞冻存管，37 ℃恒温水浴锅速融约1~2 min，离心，去上清，无菌PBS洗涤细胞，加入适量培养基，吸打成悬液，取适量注射入小鼠体腔，饲育1周后脱脊处死，无菌条件下取小鼠腹水，加入适量培养基稀释，吹打均匀，离心，去上清液，PBS洗涤，加入适量培养基重悬计数，细胞浓度约108个/mL。将36只KM雄性小鼠随机分成3组，分为空白组（Normal，N）6只、荷瘤对照组（Tumor，T）12只、药物干预组（Drug，D）18只，荷瘤对照组（T）及药物干预组（D）每只小鼠右小腿外侧皮下注射0.1 mL细胞悬液，约107个细胞。
1.3.2 小鼠分组及重组ProTα干预
将荷瘤对照组（T）随机分成T-7、T-14两组，每组6只，分别于荷瘤7 d、14 d后脱脊处死，药物干预组（D）随机分成3组（D-7、D-14、D进-7），每组各6只，D-7、D-14小鼠于移植瘤第二天每只每天腹腔注射300 ng重组ProTα[15,17]，并于药物干预7 d、14 d后分别脱脊处死，D进-7组小鼠于移植瘤后第8天开始每只每天腹腔注射注射同等剂量药物，药物干预7 d后处死。空白组小鼠（N）每只每天腹腔注射等体积无菌生理盐水，于14 d后处死。
1.3.3 计算抑瘤率
脱脊处死小鼠，无菌条件下剥离小鼠肿瘤，称取小鼠瘤重，计算抑瘤率，比较小鼠肿瘤大小及抑瘤率。 抑瘤率(％)=（荷瘤对照组平均瘤重一药物干预组平均瘤重)／荷瘤对照组平均瘤重×100％
1.3.4 流式细胞术检测Treg细胞及NKG2D阳性细胞比例
无菌条件下分离小鼠脾脏，加入适量培养基研磨，200目筛网过滤，PBS洗涤3次，淋巴细胞分离液分离外周单个核淋巴细胞（PBMC），适量PBS重悬细胞，使细胞浓度约107/mL，每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，大概106个细胞，根据说明书加入相应膜表面染色抗体，4 ℃避光孵育，PBS洗涤细胞，于Tregs标记管中加入固定/破膜工作液，避光孵育30 min，PBS洗涤，加入核内标记抗体避光孵育30 min，PBS洗涤细胞后离心去上清液，加入适量PBS重悬细胞，上机检测并分析。
1.3.5 统计分析
实验数据用SPSS18.0软件分析，计量资料用平均值±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用配对或成组t检验，p﹤0.05表示有统计学意义。
2 实验结果
2.1 药物干预的抑瘤效果分析
荷瘤组及药物干预组的肿瘤大小如图1、2所示。重组ProTα干预7 d后，干预组D-7组小鼠瘤重较荷瘤组T-7瘤重减轻，计算抑瘤率为30.41%，但差异并不显著（p=0.1489）。药物干预14 d后，干预组D-14小鼠瘤重较荷瘤组T-14明显减轻，抑瘤率为54.59%，抑瘤效果差异显著（p=0.0031）。并且，同荷瘤组T-14相比，进展期药物干预也有一定效果，抑瘤率为39.15%，两者差异显著（p=0.0184）。
图1 荷瘤组与药物干预组肿瘤
Fig. 1 The tumor of tumor-bearing group and drug intervention group
图2 荷瘤组与药物干预组瘤重
Fig. 2 The tumor weight of tumor-bearing group and drug intervention group
2.2 流式细胞术检测Treg细胞占CD4+细胞比例及NKG2D阳性细胞情况
运用流式细胞术观察CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+细胞比例，并检测PBMC中NKG2D阳性细胞的比例，其结果如图3、4所示。与空白组小鼠对比，荷瘤7 d及14 d组小鼠Treg细胞比例均不同程度升高（N vs T-7 p＞0.05，N vs T-14 p＜0.05），NKG2D阳性细胞比例下调（p＜0.05）。腹腔注射重组ProTα 7 d后，干预组较荷瘤组Treg细胞比例有所下调，NKG2D阳性细胞增加，但差异并不显著（p＞0.05）。不论是重组ProTα干预14 d组还是进展期药物干预组，Treg细胞比例均明显降低，NKG2D阳性细胞数量明显升高，统计学差异显著（p＜0.05）。
图3 CD25Foxp3Treg细胞占CD4细胞比例
Fig. 3 The proportion of CD25+Foxp3+ Treg cells in CD4+
cells ++ +
图4 NKG2D阳性细胞比例
Fig. 4 The proportion of NKG2D-positive cells
3 讨论
肿瘤免疫逃逸与肿瘤发生增殖密切相关，调节性T细胞是促进肿瘤免疫逃逸的重要细胞。Treg细胞通过识别免疫细胞表面组织相容性复合抗体，并经T细胞受体（TCR）介导提呈，抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。Foxp3是调节性T细胞特异的转录因子，Treg细胞可以通过IL-2/STAT、TGF-β/Smad通路，诱导Foxp3表达，促进肿瘤免疫逃逸[18-19]。此外，有研究显示腺苷/前列腺素E2以及凋亡途径Fas/Fasl也可能参与Treg细胞诱导的促肿瘤免疫逃逸[20-21]。Zhang等[22]发现，利用Foxp3 SiRNA转染Treg细胞，通过下调Foxp3表达，能够显著抑制Treg细胞增殖，呈现出明显的抗肿瘤效应。本项研究发现，荷瘤组小鼠Treg细胞较正常小鼠不同程度增加，并且T-14组小鼠Treg细胞比例较T-7组小鼠明显升高，瘤重明显
增加，提示Treg细胞参与肝癌细胞免疫逃逸，促进肿瘤生长，这与其他的研究是一致的[6]。而应用重组ProTα干预后，小鼠Tregs数量下调，并且干预14 d组小鼠Treg细胞数量较干预7 d组小鼠明显下调，肿瘤也明显减小，可见，重组ProTα能够通过抑制Treg细胞增殖，阻止肿瘤生长。
NKG2D/NKG2DL通路在机体的免疫监视中起重要作用，NKG2DL主要表达在肿瘤细胞和受感染细胞表面，增加NKG2D的表达能够增强机体的固有免疫。Sha等[23]对比原发性肝癌、乙型肝炎肝硬化、慢性乙型肝炎患者和健康人，发现肝癌患者中NKG2D的表达、NK细胞的活性明显低于其他组。Jiang 等[24]也发现原发性肝癌组织中NK细胞和NKG2D表达均明显低于癌旁组织，并且与肿瘤的临床分期呈负相关。在体内，肿瘤细胞通过多种途径下调NKG2D表达，逃脱免疫监视和免疫清除。Clayton等[25]发现肿瘤细胞产生大量的转化生长因子-β（TGF-β），通过降低NKG2D在CD8+T细胞及NK细胞表达，减弱NKG2D介导的抗肿瘤效应，应用TGF-β中和抗体可恢复NKG2D的表达，呈现出显著的抗肿瘤作用。在一项关于卵巢癌的研究中，Mathias等[26]发现不管是体内还是体外实验，巨噬细胞迁移抑制因子通过下调NKG2D表达，可以抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。本研究中我们发现，与正常组小鼠相比，荷瘤组小鼠NKG2D阳性细胞减少，并且对比荷瘤7 d和14 d组小鼠，我们发现荷瘤14 d小鼠NKG2D阳性细胞比例明显减少。同时我们观察到通过腹腔注射重组ProTα，肝癌小鼠NKG2D逐渐升高，并且干预时间越长，NKG2D上调越明显，对肿瘤的抑制效果越显著，而重组ProTα上调NKG2D阳性细胞的作用机制尚不清楚。但Ghiringhelli等[27]的研究表明，调节T细胞可以通过表达膜表面蛋白TGF-β，抑制NK细胞表面NKG2D的表达，降低NK细胞的杀伤作用，发挥机体的抗肿瘤作用。Smyth等[28]将Treg细胞转输至RAG-1缺陷的小鼠中，也发现Treg能够抑制NKG2D的表达和IL-12的活化，降低NK细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤生长增殖。本实验中是否存在相似的机制还需要深入研究。
综上所述，本研究通过腹腔注射重组ProTɑ，观察不同时期重组ProTα干预对移植瘤小鼠抑瘤率的影响，发现不管是肿瘤早期还是进展期，重组ProTɑ对肿瘤均有一定抑制作用，但早期、较长时间应用重组ProTα能够明显抑制肿瘤生长。对于进一步的临床应用具有指导意义。通过7 d和14 d取样对比，在一定程度上动态监测了Treg细胞、NKG2D变化情况。腹腔注射重组ProTα 14 d后，药物干预组小鼠Tregs数量较荷瘤组明显减少，NKG2D阳性细胞比例上调，抗肿瘤效应增加。以上研究结果提示，重组ProTα可通过下调Tregs数量，抑制肝癌细胞免疫逃逸，并上调NKG2D阳性细胞比例，提高NKG2D介导的抗肿瘤效应，具体的信号通路需要后续的课题进一步深入研究。
参考文献：
[1]SAKAGUCHI S, SAKAGUCHI N, ASANO M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.[J]. Journal of Immunology, 1995, 155(7):3808-3821.
[2]HE Y Q, QIAO B, WEI Y, et al. FoxP3 genetic variants and risk of non-small cell lung cancer in the Chinese Han population[J]. Gene, 2013, 531(2): 422-425.
[3]NASROLLAH E, MAHBOOBEH H S, SOMAYEH R, et al. FoxP3+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with epithelial ovarian cancer[J]. Iranian Journal of Immunology Iji, 2014, 11(2): 105-112.
[4]WINERDAL M E, PER M, MAX W, et al. FOXP3 and survival in urinary bladder cancer[J]. Bju International, 2011, 108(10): 1672-1678.
[5]XU W, LIU H, SONG J, et al. The appearance of Tregs in cancer nest is a promising independent risk factor in colon cancer[J]. Journal of Cancer Research & Clinical Oncology, 2013, 139(11): 1845-1852.
[6]张蘋, 张利宁, 朱法良等. 肝癌荷瘤小鼠调节性T细胞数量的改变及其与肿瘤生长的关系[J]. 中华肿瘤杂志, 2008, 29(5): 342-345.
[7]KONSTANTINA E, TANER S B, ONFEL B, et al. Cell surface organization of stress-inducible proteins ULBP and MICA that stimulate human NK cells and T cells via NKG2D[J]. Journal of Experimental Medicine, 2004, 199(7): 1005-1010.
[8]ANDREAS D, JENNIFER K H, MING-YU B H, et al. A novel ligand for the NKG2D receptor activates NK cells and macrophages and induces tumor immunity[J]. European Journal of Immunology, 2003, 33(2): 381–391.
[9]DIEFENBACH A, JENSEN E R, JAMIESON A M, et al. Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity[J]. Nature, 2001, 413(6852): 165-171.
[10]GROH V, WU J, YEE C, et al. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.[J]. Nature, 2002, 419(6908): 734-738.
[11]TOMOHIRO O, HIROAKI S, TOSHIAKI Y, et al. Decreased NKG2D expression on CD8+ T cell is involved in immune evasion in patients with gastric cancer.[J]. Clinical Cancer Research, 2007, 13(21): 382-387.
[12]EILERS M S, SCHIRM S, BISHOP J M. The MYC protein activates transcription of the α-prothymosin gene[J]. Embo Journal, 1991, 10(1): 133-41.
[13]郑金来. 胸腺素α原研究进展[J]. 国际免疫学杂志, 1998, (4): 210-214.
[14]王梅, 潘吉勇. 胸腺素α原与肿瘤关系的研究进展[J]. Chinese Journal of Cancer, 2007, 26(3): 333-336.
[15]蔡报伟, 栗华, 韩伟等. 胸腺素原体内抑制小鼠肝癌细胞H22的研究[J]. 中国免疫学杂志, 2012, 28(5): 412-414.
[16]韩伟. 重组人胸腺素α原抗肿瘤活性及机理研究[D]. 厦门大学, 2011.
[17]周克夫, 厦门伯赛基因转录技术有限公司. 胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用:中国, CN201210086166.0[P]. 2012-7-18.
[18]ZORN E, NELSON E A, MOHSENI M, et al. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo[J]. Blood, 2006, 108(5): 1571-1579.
[19]MASSAGUE J. GOMIS R R. the logic of TGF-beta signaling. FEBS Lett. 2006. 580(12): 281l-2820．
[20]MAGIS M, WHITESIDE T L. Targeting human inducible regulatory T cells (Tr1) in patients with cancer: blocking of adenosine-prostaglandin E(2) cooperation[J]. Expert Opinion on Biological Therapy, 2011, 11(9): 1203-1214.
[21]STRAUSS L, BERGMANN C T. Human circulating CD4+ CD25high Foxp3+ regulatory T cells kill autologous CD8+ but not CD4+ responder cells by Fas-mediated apoptosis[J]. Journal of Immunology, 2009, 182(3): 1469-1480.
[22]ZHANG H H, FEI R, XIE X W, et al. Specific suppression in regulatory T cells by Foxp3 siRNA contributes to enhance the in vitro anti-tumor immune response in hepatocellular carcinoma patients[J]. Journal of Peking University(Health Sciences), 2009, 41(3): 313-318.
[23]SHA W H, ZENG X H, MIN L. The correlation between NK cell and liver function in patients with primary hepatocellular carcinoma.[J]. Gut Liver, 2014, 8(3): 298-305.
[24]JIANG J H, ZHOU Z F, LI J Y, et al. Expression and significance of the NK cell receptors in primary hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues[J]. Chinese journal of cellular and molecular immunology, 2012, 28(5): 529-532.
[25]CLAYTON A, MITCHELL J P, COURT J, et al. Human tumor-derived exosomes down-modulate NKG2D expression[J]. Journal of Immunology, 2008, 180(11): 7249-7258.
[26]MATHIAS K, YVONNE D, CLAUDIA W, et al. Macrophage migration inhibitory factor contributes to the immune escape of ovarian cancer by down-regulating NKG2D[J]. Journal of Immunology, 2008, 180(11): 7338-7348.
[27]GHIRINGHELLI F, MENARD C, TERME M, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit natural killer cell functions in a transforming growth factor-beta-dependent manner[J]. Journal of Experimental Medicine, 2005, 202(8):1075-1085.
[28]SMYTH M J, TENG M W L, JEREMY S, et al. CD4+CD25+ T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer[J]. Journal of Immunology, 2006, 176(3): 1582-1587.
Influence of Proportion of Treg Cells and NKG2D-positive Cells by Recombinant ProTα in
Mices Bearing Liver Cancer
CHEN Wei1, 3, ZHOU Kefu2, LI Hua3*
(1. Graduate School of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China; 2. College of Environment and Ecology of Xiamen University, Xiamen 361005, China; 3. The First Affiliated Hospital of
Xiamen University, Xiamen 361005, China)
Abstract: To observe the tumor inhibition rate by recombinant ProTα in liver cancer-bearing mice model, and to study the influence of the proportion of Treg cells and NKG2D-positive cells, 36 KM mices were randomly divided into control group, tumor-bearing group and drug intervention group, and a tumor-bearing mice model was established by transplanting H22 cells subcutaneously. By medicating recombinant ProTα through intraperitoneal injection, we observed the tumor inhibition rate after 7 days and 14 days, and detected the proportion of Treg cells and NKG2D-positive cells in PBMCs. The distinguish of tumor weight between tumor-bearing group and drug intervention group is not significant after bearing tumor 7 days. However, after bearing tumor 14 days, the distinguish of tumor weight is significant.And after bearing tumor 14 days, the proportion of Treg cells rises and the number of NKG2D-positive cells declines significantly in the tumor-bearing group. No matter 14 days intraperitoneal injection of recombinant ProTα or drug intervention from the advanced stage, the proportion of Treg cells declines and the number of NKG2D-positive cells rises significantly. The results suggest that recombinant ProTα inhibits tumor growing, and the early and long-term drug intervention benefits the most. The putative mechanism is related to that recombinant ProTα down-regulates the proportion of Treg cells, inhibiting the immune escape of hepatocellular carcinoma cells, and up-regulates the number of NKG2D-positive cells, improving the NKG2D-mediated anti-tumor effect.
Key words: recombinant ProTα; liver cancer; regulatory T cell; NKG2D
重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细 胞的影响 陈 炜1,3，周克夫2，栗 华3* （1. 福建中医药大学研究生院，福建 福州，350108；2. 厦门大学环境与生态学院，福建 厦门，361005； 3. 厦门大学附属第一医院，福建…
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