爱华网中国组织工程研究 第21卷 第8期 2017–03–18出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 18, 2017 Vol.21, No.8
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低频超声促透通络止痛中药对膝骨关节炎尿激酶型 纤溶酶原激活物系统及炎性因子的影响
张 红，任东升，陶雅非(南阳市中心医院肾病风湿免疫科，河南省南阳市 473400)
·研究原著·
引用本文：张红，任东升，陶雅非. 低频超声促透通络止痛中药对膝骨关节炎尿激酶型纤溶酶原激活物系统及炎性因子的影响[J].中国
组织工程研究，2017，21(8):1149-1154.
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.001 ORCID: 0000-0001-9061-0467(张红)
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文题释义：
超声透入法：称作超声波法，是指运用超声波促使药物透过完整皮肤而进入软组织的方法。 低频超声促透通络止痛中药：通络止痛中药在低频超声促透特有的空化作用下，可以使通络止痛中药透过皮肤障碍到达患处直达病灶，形成局部浓集和浸润而起到通经活络、消炎止痛的作用。
张红，女，1980年生，河南省南阳市人，汉族，2009年广西中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事肾病风湿免疫方向研究。
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)08-01149-06 稿件接受：2016-12-27
摘要
背景：低频超声促透中药复方治疗骨关节炎可有效减轻患者疼痛，改善关节功能，但其作用机制尚不清楚。 目的：观察低频超声促透通络止痛中药对膝骨关节炎模型兔尿激酶型纤溶酶原激活物系统及炎性因子的影响，探讨低频超声促透通络止痛中药的作用机制。
方法：40只新西兰大白兔随机分为4组：正常组、模型组、对照组和实验组。正常组正常饲养，不进行膝骨关节炎造模处理，其余3组均在兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶制作骨关节炎模型，实验组造模后1周给予低频超声促透通络止痛中药治疗，对照组造模后1周给予生理盐水，模型组造模后正常饲养，不进行其他干预。治疗3周后检测血清、关节液中炎性因子水平，对滑膜和关节软骨进行Mankin’s评分，采用Western Blot方法检测关节滑膜中尿激酶型纤溶酶原及其受体蛋白的表达。
结果与结论：①模型组血清、关节液中炎性因子水平与正常组比较明显升高(P < 0.05)，实验组血清、关节液内炎性因子水平与模型组比较显著降低(P < 0.05)；②实验组滑膜组织Mankin’s评分低于模型组和对照组(P < 0.05)，而软骨组织评分与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③与模型组比较，实验组关节滑膜尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体表达明显降低，尿激酶型纤溶酶原激活物抑制剂表达升高；④结果表明，低频超声促透通络止痛中药可以抑制关节液和血清炎性因子的生成，减轻膝关节局部的炎症反应，进而有效治疗膝骨关节炎。 关键词：
组织构建；骨组织工程；低频超声；通络止痛中药；膝骨关节炎；uPA系统；炎性因子；组织工程 主题词：
超声透入疗法；中草药；骨关节炎, 膝；尿激酶型纤溶酶原激活剂；炎症；组织工程
Effects of low-frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs on
urokinase-type plasminogen activator system and inflammatory cytokines in knee osteoarthritis
Zhang Hong, Master, Attending physician, Department of Nephropathy Rheumatology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473400, Henan Province, China
Zhang Hong, Ren Dong-sheng, Tao Ya-fei (Department of Nephropathy Rheumatology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473400, Henan Province, China)
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1149
张红，等. 低频超声促透通络止痛中药对膝骨关节炎尿激酶型纤溶酶原激活物系统及炎性因子的影响 www.
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Abstract
BACKGROUND: Low-frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs can effectively relieve pain and improve joint function of patients with osteoarthritis, but the underlying mechanisms are still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of low-frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs on urokinase-type plasminogen activator (uPA) and inflammatory cytokines of osteoarthritis rabbits and the related mechanisms.
METHODS: Forty rabbits were randomly divided into four groups: normal, model, control, and experimental groups. The normal group was treated with normal feeding, not for any processing. For the other three groups, papain was injected into the rabbit knee articular cavity to establish osteoarthritis models. One week later, the experimental group was treated with low frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs for 3 weeks, the control group treated with the same volume of normal saline, and the model group received no intervention. The levels of inflammatory cytokines in the serum and synovial fluid were measured, the histological changes of synovial tissues and articular cartilage were evaluated using Mankin’s score, and the expression levels of uPA and its receptor were determined by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of inflammatory cytokines in the model group were significantly higher than those in the normal and experimental groups (P < 0.05). The Mankin’s scores of synovial tissue in the experimental group were significantly lower than those in the model and control groups (P < 0.05), while Mankin’s scores of the
cartilage tissue had no significant difference between the experimental and model groups (P > 0.05). Compared with the model group, in the experimental group, the expression levels of uPA and its receptor were significantly downregulated, and the expression of uPA inhibitor was notably upregulated. These data show that low-frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs attenuates inflammatory reaction in the synovial tissues, by inhibiting the formation of joint fluid and production of inflammatory cytokines, which is an effective treatment for knee osteoarthritis.
Subject headings: Phonophoresis; Drugs, Chinese Herbal; Osteoarthritis, Knee; Urokinase-Type Plasminogen Activator; Inflammation; Tissue Engineering
Cite this article: Zhang H, Ren DS, Tao YF. Effects of low-frequency ultrasound combined with Tongluo Zhitong herbs on urokinase-type plasminogen activator system and inflammatory cytokines in knee osteoarthritis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(8):1149-1154.
0 引言 Introduction
骨性关节炎又叫退行性关节炎，实际上并非炎症，主要为退行性变，属关节提前老化，特别是关节软骨的老化。炎[1-2]。膝骨关节炎患者下楼梯、下蹲、站起都会产生困难。目前关于膝骨关节炎治疗方法分为保守治疗和手术治疗2种[3]。有研究指出，关节清理术不能有效改善患者的膝骨关节炎症状[4-5]，而膝关节置换费用昂贵，置换后并发症发生率较高，且患者多为老年，不适宜进行大型手术。
中药在减轻关节炎症状、活血止痛方面有良好的效果[6]。中药外治是中医治疗的一大特色，运用中药直接治疗患处，使药物直达病所，而且不良反应小、简便经济。虽然中药在膝骨关节炎治疗上取得一定的效果，但中药的有效成分不能很好地渗透到患处，使药效发挥效果有限。因此，如何使中药透过皮肤屏障，发挥中药外用治疗的效果，是目前骨关节炎治疗中亟待解决的问题。改变传统的中医给药途径，发挥中国传统医学的优势，结合现代科学的各种先进手段，可以在治疗骨性关节炎上取得重大进展。
随着科学技术的飞速发展，低频超声促透法广泛应用于临床。超声透入法也称作超声波法，是指运用超声波促使药物透过皮肤而进入软组织的方法。自从Leitgeb采用超声波导入氢化可的松软膏治疗多发性手指关节炎，取得较好的临床效果[7]，人们就开始进行超声波导入药物透皮研究，但是有报道指出，不同的超声频率会对治疗效果产生重要影响，频率在1-3 MHz的超声促透治疗效果不明显，
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甚至没有促透作用[8-9]。随着临床研究不断深入，一些学者发现20 kHz的低频超声波具有较好的促透作用，尤其是对于一些生物大分子药物的促透作用[10-11]。在低频超声促透到达患处的大分子物质直达病灶，形成局部浓集和浸润而起到靶位治疗的作用[12]。国内学者也开始展开对低频超声促透法促进药物透皮吸收的一系列研究[13-15]，例如低频超声波促透重酒石酸卡巴拉汀经皮渗透的促进作用，取得显著效果[16]。已有研究证实低频超声促透通络止痛中药减轻膝骨关节炎患者疼痛的效果[14
，17-18]
骨性关节炎代表着关节的衰老，故称之为老年性关节 特有的空化作用下，可以使中药中许多很难透过皮肤障碍
。实验观察低频超声促
透通络止痛中药对膝骨关节炎模型兔关节滑膜组织尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)系统及炎性因子的影响，探讨低频超声促透通络止痛中药的作用机制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 单一变量，对比分析。
1.2 时间及地点 实验于2013年1月至2015年6月在南阳市动物疫病控制中心实验室完成。 1.3 材料
1.3.1 实验动物 40只健康成年新西兰大白兔，雌雄各半，体质量3.0-3.5 kg，由中国药品生物制品检定所动物繁殖中心提供。
1.3.2 实验试剂和仪器 木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)；放射免疫试剂盒(北京华英生物技术研究所)；白细胞介素1β试剂盒、COMP试剂盒、肿瘤坏死因子α试剂盒和一氧
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化氮试剂盒(北京华英生物技术研究所)；低温离心机8510R(德国Eppendorf公司)。GAPDH抗体、uPA抗体、uPAR抗体和uPAI-1抗体(美国Santa Cruz公司)；RIPA裂解试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)。
1.4 实验方法
1.4.1 复制实验性骨性关节炎动物模型 采用兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶的方法制备骨关节炎模型[18]。将大白兔用3%戊巴比妥钠麻醉后，消毒周围皮肤，使大白兔的膝关节弯曲，经关节正中或两侧进针，将1.6%木瓜蛋白酶溶液0.3 mL通过髌上韧带注入兔右膝关节腔，每3 d注射1次，连续注射3次。
1.4.2 动物分组和处理 将40只大白兔随机分为4组(n=10)：正常组、模型组、实验组、对照组。正常组正常饲养，不进行膝骨关节炎造模处理，其余3组均进行膝骨关节炎造模处理，实验组造模后1周给予低频超声促透通络止痛中药治疗，对照组造模后1周给予低频超声促透生理盐水，模型组造模后正常饲养，不进行其他干预。为了避免麻药对大白兔的血液动力学产生影响，采用透明胶带将大白兔固定在实验台上。每次实验前用脱毛剂脱掉右膝关节周围毛，并保持皮肤完好无损。
超声促透参数：功率30 W，频率20 kHz，透入速率为30-60 μg，每次30 min，每周3次，共治疗3周，超声探头要垂直于皮肤表面，液体和皮肤紧密接触。
1.4.3 采集关节液、血清标本 将大白兔固定在实验台上，左手摸准大白兔心尖搏动最强处，消毒后右手将针头在此处稍向上刺入，回血后即可缓慢抽血3 mL，静置离心，吸取血清放入EP管内，-20 ℃低温保存。于关节外侧进针，刺入关节腔，回抽无血后注入1 mL生理盐水，回抽3次，获取关节冲洗液0.5 mL，离心取上清液，-20 ℃低温保存。 1.5 主要观察指标
1.5.1 膝关节Lequesne MG评级 采用Lequesne MG指数评估各组大白兔的疼痛反应、步态、关节肿胀、关节活动度等指标。
(1)按照疼痛刺激反应分为4级：无疼痛反应为Ⅰ级；轻微疼痛反应为Ⅱ级；患肢收缩、痉挛并伴有轻微全身反应为Ⅲ级；患肢剧烈收缩、痉挛、挣扎等并伴有剧烈疼痛反应为Ⅳ级。
(2)按照步态分4级：无跛行为Ⅰ级；轻度跛行为Ⅱ级；明显跛行为Ⅲ级；患肢不能着地为Ⅳ级。
(3)按照关节肿胀程度分4级：无肿胀为Ⅰ级；轻度肿胀为Ⅱ级；重度肿胀为Ⅲ级；骨性标记消失为Ⅳ级。
(4)按照关节活动度分为4级：90°以上为Ⅰ级，45°-90°为Ⅱ级；15°-44°为Ⅲ级；15°以下为Ⅳ级。
1.5.2 血清、关节液炎性因子水平 取聚苯乙烯试管编号，按照白细胞介素1β、转化生长因子α、COMP试剂盒操作说明书进行实验，将缓冲液、标准品、样品、抗血清
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等液体混匀，室温放置15 min，离心后取沉淀部分测定放射性计数。按照一氧化氮试剂盒操作说明，采用硝酸还原酶法测定血清、关节液一氧化氮水平。
1.5.3 关节软骨、滑膜形态学 取模型组、实验组和对照组大白兔，麻醉后处死，打开膝关节，先大体观察关节软骨和滑膜情况，然后完整切取滑膜及关节软骨，置于甲醛溶液中固定72 h，再脱钙1周，常规脱水、包埋、切片，行苏木精-伊红染色。采用Mankin’s评分标准对滑膜和关节软骨进行评分[17]。
1.5.4 采用Western Blot方法检测关节滑膜中uPA及其受体蛋白的表达 采集各组大白兔的滑膜组织，玻璃匀浆器冰上匀浆，进行超声破碎，加入裂解液RIPA裂解40 min， 然后4 ℃，12 000 r/min离心5 min萃取蛋白质，BCA蛋白定量后，进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后，转移至硝酸纤维素膜，加入封闭液室温孵育30 min，分别加入一抗uPA抗体(1︰1 000)、uPAI-1抗体(1︰1 000)、uPAR抗体(1︰1 000)和GAPDH抗体(1︰4 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤2次，加入相应二抗室温孵育1.5 h，TBST洗涤2次，化学发光法显色，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析目标条带。
1.6 统计学分析 采用SPSS11.0对数据进行统计学分析，多组计量资料采用F 检验，计数资料采用χ2检验， P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 参加实验的40只大白兔全部进入实验统计，中途无脱落。
2.2 各组兔膝关节Lequesne MG评估指数比较 模型组关节活动度、步态以及关节肿胀情况与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但是局部反应比较差异无显著性意义(P > 0.05)；给予3周低频超声促透通络止痛中药治疗后，实验组关节活动度、步态以及关节肿胀情况相对模型组具有重大改善(P < 0.05)，见表1。
2.3 各组兔关节液中炎性因子水平比较 模型组兔关节液中的肿瘤坏死因子α、COMP、一氧化氮、白细胞介素1β炎性因子水平显著高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)，给予3周低频超声促透通络止痛中药治疗后，实验组兔关节液中的肿瘤坏死因子α、COMP、一氧化氮因子和白细胞介素1β水平低于模型组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。
2.4 各组兔血清中炎性因子水平比较 模型组兔血清中的肿瘤坏死因子α、COMP、一氧化氮和白细胞介素1β炎性因子水平显著高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)，给予3周低频超声促透通络止痛中药治疗后，实验组兔关节液中的肿瘤坏死因子α、COMP、一氧化氮因子和白细胞介素1β水平低于模型组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。
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图1 各组兔滑膜组织uPA、uPAR、uPAI-1蛋
白表达 3.0
Figure 1 Expression levels of urokinase-type a
2.5 plasminogen activator, urokinase-type
2.0 plasminogen activator receptor, and
b
b 1.5 urokinase-type plasminogen activator
b
inhibitor-1 in the rabbit synovial tissues in each 1.0
group 0.5 a a
图注：1为正常组；2为模型组；3为对照组；
4为实验组。与正常组比较，aP < 0.05；与模型
1 2 3 4 组比较，bP < 0.05。
表1 膝关节Lequesne MG评估指数比较 (n)
Table 1 Comparison of the Lequesne MG indexes of the knee among groups
1 2 3 4
组别 疼痛反应 Ⅰ级+Ⅱ级 10 3 3 2 1.021 0.261
Ⅲ级+Ⅳ级 0 7 7 8
相对表达量
步态情况 Ⅰ级+Ⅱ级 10 0 2 0 3.970 0.024
Ⅲ级+Ⅳ级 0 10 8 10
关节肿胀 Ⅰ级+Ⅱ级 10 3 7 4 4.037 0.014
Ⅲ级+Ⅳ级 0 7 3 6
关节活动度 Ⅰ级+Ⅱ级 10 0 4 1 17.493 0.000
Ⅲ级+Ⅳ级 0 10 6 9
正常组
模型组
实验组 对照组 χ2 P
表2 各组关节液中炎性因子水平比较 (x±s， n=10，μg/L) Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in the
synovial fluid among groups
_
表3 各组血清中炎性因子水平比较 (x±s， n=10，μg/L) Table 3 Comparison of the serum levels of inflammatory cytokines among groups
组别
白细胞介素1β 肿瘤坏死因子α COMP
一氧化氮
_
组别 白细胞介素1β 肿瘤坏死因子α COMP 一氧化氮
实验组 0.107±0.032bc 1.252±0.201bc 对照组 0.281±0.239a 模型组 0.247±0.038a
1.619±0.239a 1.648±0.382a 1.080±0.227 2.273 0.030
10.201±2.831bc 39.288±6.392bc 15.339±2.031a 15.492±1.383a 8.983±1.325 2.169 0.040
62.384±5.493a 64.383±5.442a 39.971±5.403 3.012 0.005
实验组 0.467±0.112bc 4.252±0.221bc 对照组 0.833±0.392a 模型组 0.876±0.048a 正常组 0.235±0.043 F P
2.351 0.025
6.221±1.730bc 41.238±7.252bc
11.702±0.306a 14.259±2.501a 52.738±8.493a 11.768±0.408a 14.720±1.440a 59.938±5.833a 1.083±0.527 2.757 0.009
1.983±1.435 2.315 0.029
32.354±5.043 2.169 0.040
正常组 0.089±0.033
F P
2.390 0.024
表注：与正常组比较，aP < 0.05，与模型组比较，bP < 0.05，与对照组比较，
c
表注：与正常组比较，aP < 0.05，与模型组比较，bP < 0.05，与对照组比较，
c
P < 0.05。 P < 0.05。
_
表4 各组光镜下Mankin’s组织学评分比较 (x±s， n=10)
Table 4 Comparison of the Mankin’s scores under light
microscope among groups
组别
软骨组织评分 10.832±1.463 10.902±1.202 10.362±1.322 10.838±1.455 1.292 0.256
滑膜组织评分 7.203±1.203b 12.893±2.050 13.049±2.103a 3.216±0.701 12.922 0.000
a
实验组干预治疗3周后，关节软骨色泽较模型组明亮，局部软化，滑膜滑液量较模型组少。
2.6 各组兔光镜下软骨、滑膜Mankin’s组织学评分比较 每个标本取5张切片，每张选取3个视野，在不同时间由两个专业病理科医师进行Mankin’s组织学评分。治疗后，实验组兔的滑膜局部炎性细胞浸润较模型组少，滑膜Mankin’s组织学评分与模型组比较，差异有显著性意义 (P < 0.05)，关节软骨仍有表层细胞增生，却发现软骨细胞成簇出现，而软骨Mankin’s组织学评分与模型组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。
2.7 各组兔滑膜组织uPA、uPAR、uPAI-1表达 模型组兔滑膜组织的uPA和uPAR表达高于正常组，兔滑膜组织的uPAI-1表达低于正常组；治疗3周后，实验组兔滑膜组织的uPA和uPAR表达明显降低，uPAI-1表达升高，见图1。
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实验组
模型组
对照组
正常组
F
P
表注：与正常组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。
2.5 各组兔关节软骨组织、滑膜大体观察结果 模型组关节软骨局部出现溃疡、软化，表面较粗糙，滑膜充血，出现水肿现象，滑液量增多；对照组关节软骨局部出现溃疡；
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